Development of laser-induced graphene impedimetric biosensors for Escherichia coli detection

Abstract

In this work, it was intended the development of a laser induced graphene (LIG) impedimetric immunosensor for Escherichia coli detection. This investigation was explored in cooperation with Bosch Thermotechnology S.A. Aveiro within the co-promoted Smart Green Home project. To start, LIG electrodes were produced, fixating all the laser parameters with exception of the laser scan speed, vlaser, for which five values (150, 200, 250, 300 and 350 mm/s) were explored. A comprehensive study to compare the five vlaser was done through Raman spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM) and determination of the respective electrochemical parameters: heterogeneous charge transfer rate constant, k0, effective electroactive area, Aeff, and capacitance per unit area, 𝛾"#. As a result, the sample produced with 250 mm/s was chosen to proceed with functionalisation, being subjected to X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Afterwards, a four steps functionalisation, comprehending hydroxylation, APTES silanization, anti-E.coli covalent immobilisation and BSA passivation, was studied through electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV). Particularly, it was explored the need to perform hydroxylation using Raman spectroscopy, XPS and determination of the corresponding k0, Aeff and 𝛾"#. Also, in the case of APTES silanization, it was relevant to establish the respective k0, Aeff and 𝛾"# to better understand the EIS and CV measurements. Consequently, a suitable functionalisation protocol was achieved. Lastly, the biosensing response of the produced biosensors was investigated by EIS towards 7 E. coli concentrations (5, 10, 102, 103, 104, 105, 106 CFU/mL). These tests also comprised false-positive and selectivity controls. However, the obtained results were inconclusive regarding E. coli detection, so a set of confirmatory tests was established using two strains of E. coli to verify the efficiency of antibody-antigen interaction. To prove E. coli detection, the biosensors, upon bacteria immobilisation, were submitted to EIS measurements, bacterial DNA tests and SEM analysis. In fact, E. coli detection was confirmed

No presente trabalho, pretende-se desenvolver imunossensores impedimétricos à base de grafeno induzido por laser (LIG) para deteção de E. coli. Este estudo foi desenvolvido em colaboração com a Bosch Termotecnologia, S.A. Aveiro, no âmbito do projecto Smart Green Homes em co-promoção. Primeiramente, procedeu-se à produção de elétrodos de LIG, explorando o efeito da velocidade de varrimento do feixe laser, vlaser, sobre a folha de poliimida (Kapton®). Para tal, foram estudados 5 valores: 150, 200, 250, 300 e 350 mm/s. De forma a comparar o efeito das diferentes velocidades de varrimento, foi realizada uma caracterização abrangente através das técnicas de espetroscopia de Raman, microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e caracterização eletroquímica, definindo as respetivas constante de transferência de carga heterogénea, k0, área eletroquímica efetiva, Aeff, e capacitância por unidade de área, 𝛾"#. De acordo com os resultados obtidos, a amostra de LIG produzida com 250 mm/s foi selecionada para continuar o trabalho, nomeadamente, a funcionalização. Para tal, a amostra foi analisada por espetroscopia de fotoeletrões excitados por raios-X (XPS). O protocolo de funcionalização foi estudado por espetroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e voltametria cíclica (CV). O processo de funcionalização foi dividido em quatro passos: hidroxilação, silanização de APTES, funcionalização covalente do anti-E. coli e passivação com BSA. Em particular, foi estudada a necessidade de hidroxilar os elétrodos de LIG recorrendo à espetroscopia de Raman, XPS e à respetiva caracterização eletroquímica (k0, Aeff and 𝛾"#). Além disso, também foi considerado relevante, para compreender os resultados obtidos através de EIS e CV, realizar a caracterização eletroquímica das amostras silanizadas com APTES. Deste modo, foi possível estabelecer um protocolo de funcionalização apropriado à aplicação em vista. A resposta dos biossensores desenvolvidos foi testada através de medidas de EIS, utilizando 7 concentrações de E. coli (5, 10, 102, 103, 104, 105, 106 CFU/mL). Nestes testes também foram contemplados controlos para determinação de falsos-positivos e seletividade. Contudo, os resultados obtidos foram inconclusivos relativamente à deteção de E. coli, levando ao planeamento de novos testes. Desta forma, recorreu-se a duas estirpes de E. coli e a testes de EIS, de DNA bacteriano e análise de SEM, com os quais se provou que os sensores produzidos são capazes de detetar E. coli