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Title: Caracterização genética e bioquímica do antibiótico peptídico produzido pela estirpe de Bacillus licheniformis I89
Author: Faustino, Nuno André Rodrigues
Advisor: Mendo, Sónia
Defense Date: 2001
Abstract: Num programa de screening a partir de amostras de sedimento recolhidas à entrada do canal de Ílhavo (Ria de Aveiro), isolaram-se várias estirpes bacterianas. Duas destas estirpes, denominadas de 4 e 6, possuem a capacidade de produção de compostos com actividade antimicrobiana sobre bactérias Gram +. A produção destes compostos obtida, para ambas as estirpes, em meio TSB e à temperatura ambiente, mostra que a produção máxima ocorre às 28 horas e entre as 16 e as 18 horas de fermentação para as estirpes 4 e 6 respectivamente. A estirpe de Bacillus licheniformis I89 produtora do antibiótico peptídico A89, activo sobre bactérias Gram +, tinha sido previamente isolada de uma nascente quente por um método semelhante ao utilizado neste trabalho. Verificou-se que a produção deste composto não era aumentada pela adição de alguns iões ao meio de cultura, nomeadamente Co2+, Fe2+, Mg2+ e Mn2+. A purificação do antibiótico A89 foi efectuada por RP-HPLC mostrando um tempo de retenção de 21,80 minutos. Por análise de espectrometria de massa determinou-se o tamanho do péptido como sendo de 3249,7 Da. A caracterização bioquímica do antibiótico A89 revelou que este é resistente à acção de enzimas proteolíticas como as cardosinas A e B, a quimotripsina, a tripsina e a endoproteinase V8. A actividade do antibiótico A89 não é afectada pela incubação a diferentes pHs, mantendo alguma da sua actividade após incubação durante seis horas a 100ºC. A incubação a 4 ºC do antibiótico A89 mostrou que a sua actividade antimicrobiana se mantêm inalterada durante os doze meses testados. Completou-se a determinação da sequência nucleotídica de dois domínios de activação da péptido sintetase responsável pela síntese do antibiótico A89, verificando-se que estes activam os aminoácidos valina e leucina. Foram ainda identificados outros dois domínios de activação de aminoácidos incompletos. No entanto é possível prever que um active uma leucina e o outro um aspartato ou uma asparagina. A análise das sequências proteicas deduzidas a partir das ORF, mostrou uma elevada semelhança das duas sequências com outros genes responsáveis pela biossíntese de péptido sintetases, em particular com a péptido sintetase da lichenisina. Foi construído o mapa de restrição do plasmídeo críptico pI89, de 8,3 Kb. A sequência nucleotídica de cerca de 2,0 Kb foi determinada, não tendo sido identificados, por comparação com outras sequências depositadas nas bases de dados, sequências pertencentes a genes de bactérias.
From a screening program, two antibiotic producing strains with activity against Gram-positive bacteria were isolated from the Ílhavo bracket (Ria de Aveiro). To both strains, denominated 4 and 6, the antibiotic production was determined at room temperature in TSB medium. Strain 4 reached its maximum production after 28 hours of fermentation, while to the strain 6 it was obtained between the 16 and the 18 hours of growth. The Bacillus licheniformis I89 strain, producer of the peptidic antibiotic A89 active against Gram-positive bacteria, was previously isolated from an hot spring environment by a similar method. It was shown that the addition of some ions to the culture medium, namely Co2+, Fe2+, Mg2+, and Mn2+, does not increase the production of this antibiotic. Purification of the antibiotic A89 was performed by RP-HPLC and showed a retention time of 21.80 minutes. The analysis of this peak by mass spectrometry, revealed that it has mainly one compound with a mass of 3249.7 Da. The biochemical characterisation of the antibiotic A89 revealed that it is resistant to the action of enzymes such as cardosins A and B, quimotripsin, tripsin and endoproteinase V8. Antibiotic activity is not affected by the incubation at pH values ranging from 3.8 to 8.0 and also maintain some of its activity after incubation for six hours at 100 ºC. The antibiotic A89 activity remain unaltered after one year at 4 ºC. The determination of the nucleotidic sequence of two different domains of the peptide synthetase responsible for the synthesis of the antibiotic A89 was completed. The amino acid activated by these domains are a valine and a leucine. Two more domains were identified but their nucleotidic sequence was not completed. Nevertheless, it was possible to identify that they activate one leucine and one aparagine or aspartic acid. The analysis of the protein sequence deduced from the ORF revealed a high degree of similarity with several genes coding for peptide synthetases, in particular with the peptide synthetase of lichenysin. A restriction map of the criptic plasmid from B. licheniformis I89 was made and its size was estimated as 8.3 Kb. The nucleotidic sequence of 2.0 Kb was determined. This sequence did not reveal any similarity with bacterial genes or genes contained in other plasmid vectors.
URI: http://hdl.handle.net/10773/25781
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