Efeito dos solventes orgânicos na estrutura da Cardosina A

Abstract

Nas duas últimas décadas a enzimologia não aquosa tem-se tornado industrialmente importante, promovendo os estudos das propriedades dos solventes que controlam a especificidade, actividade e estabilidade das enzimas. Até hoje, maior importância tem sido dada à actividade catalítica das enzimas e ao potencial para aplicação prática. Para o desenvolvimento da área da enzimologia não aquosa, são necessários estudos de estabilidade, que relacionem a estrutura e função catalítica do biocatalisador com as condições do meio, bem como o uso de outros modelos de enzimas que completem o conhecimento alcançado até hoje. A cardosina A é uma protease aspártica, activa na presença de solventes orgânicos e capaz de sintetizar péptidos em sistemas bifásicos, com uma eficiência comparável à da pepsina, com a sua estrutura primária, secundária, terciária e quaternária elucidada. No sentido do estabelecimento de técnicas que permitam o estudo das alterações conformacionais e estabilidade da cardosina A em sistemas com solventes orgânicos e relacioná-los com o seu desempenho catalítico, foi realizado um estudo integrado de calorimetria, espectroscopia (fluorescência e CD). Foi feita a caracterização fundamental da estabilidade estrutural da cardosina A em meio aquoso sem adição de solventes orgânicos, avaliando o efeito da temperatura e do pH. Relativamente ao conteúdo em estruturas secundárias da cardosina A, foram caracterizados os estados nativo e desnaturado termicamente, por dicroismo circular. Deste modo, este estudo servirá como referência nos estudos de estabilidade estrutural da cardosina A em meios com solventes orgânicos. Considerando a estabilidade da função catalítica, foram estudadas as estabilidades operativa e de armazenamento da cardosina A no meio aquoso e em sistemas com solventes orgânicos, a 25ºC e a pH óptimo de actividade. Os resultados foram relacionados com a natureza hidrofóbica dos solventes, indicado pelo valor de log P. Finalmente, e no sentido de estabelecer metodologias que permitam o estudo, a um nível molecular, das alterações estruturais, induzidas por solventes orgânicos na cardosina A, foi proposta uma nova abordagem. Esta abordagem concilia o uso de proteases como sondas moleculares da estrutura com estudos de enzimologia não aquosa. Deste modo, foram conduzidas digestões da cardosina A nos sistemas com solventes orgânicos em estudo, pela endoproteinase Glu-C, tripsina e quimotripsina, sendo analisada a susceptibilidade proteolítica por SDS-PAGE. Adicionalmente, foi feito o mapeamento da acção proteolítica da endoproteinase Glu-C, na cardosina A, permitindo a localização, a um nível molecular, de alterações conformacionais induzidas por solventes.

Over the past two decades, nonaqueous enzimology has gained industrial interest, promoting studies of the solvent properties that control enzyme specificity, activity and stability. To date the major attention has been given to catalytic activity of enzymes and their potential for practical application. For the development of nonaqueous enzymology stability studies to analyse the biocatalyst structure and function according to the media composition are necessary, as well as the need of studying other model enzymes. Cardosin A is an aspartic proteinase that is active in the presence of organic solvents, being capable to perform peptide synthesis in biphasic systems with efficiency comparable to pepsin. Its primary, secondary, terciary and quaternary structure has already been determined. An integrated approach of both calorimetric and spectroscopic studies (fluorescense and circular dicroism) were performed for the establishment of techniques to study stability and conformational alterations of cardosin A in the presence of organic solvents relating it to its catalytic performance. The structural stability of cardosin A was achieved in aqueous media without the adition of organic solvents, by studying the effects of temperature and pH. Concerning cardosin A secondary structure content, both native and thermally denaturated states were caracterised, by circular dicroism. In this way these studies will be used as a reference to study the structural stability of cardosin A in organic solvent media. Considering the stability of the catalytic action of cardosin A, operational and storage stabilities studies were performed in aqueous media and in organic solvents systems, at 25ºC and at optimum pH conditions. Results were discussed accordingly to the hydrophobic nature of solvents, indicated by log P values. Finnally, and with the aim of establishing methodologies that allows an analysis, at the molecular level, of structural alterations induced by the presence of organic solvents in cardosin A, a new approach was presented. This approach combines the use of proteases as molecular probes with nonaqueous enzymology studies.So, cardosin A digestion in aqueous and organic solvent systems with endoproteinase Glu-C, trypsin and chymotrypsin were conducted, being the proteolytic susceptibility monitored by SDS-PAGE. Furthermore, cardosin A maping of the proteolytic action of endoproteinase Glu-C was achieved, allowing the molecular determination of conformational alterations induced by organic solvents.