Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/25739
Title: Utilização de uma enzima vegetal na prevenção de fibroses e aderências
Author: Duarte, Ana Sofia Direito dos Santos
Advisor: Pires, Euclides Manuel Vieira
Barros, Marlene Maria Tourais
Defense Date: 2001
Abstract: A formação de aderências pós cirúrgicas é um problema clínico sério, constituindo uma das principais causas de morbilidade e de custos, e em alguns casos, pode, inclusivamente, causar a morte dos pacientes. Esta patologia está associada à fibrose, que é caracterizada por síntese e deposição excessiva de tecido conjuntivo, principalmente fibras de colagénio, de forma a alterar a estrutura normal do tecido, comprometendo o normal funcionamento do orgão afectado. Devido à resistência do colagénio fibrilar à maioria das enzimas proteolíticas, e tendo como último objectivo a utilização da cardosina A na prevenção clínica de fibroses e consequente formação de aderências , foi estudada a acção desta enzima colagenolítica sobre o colagénio do tipo I humano. Os resultados obtidos mostram que a cardosina A é capaz de clivar o colagénio do tipo I no interior das α-hélices. O padrão de digestão produzindo é mantido até às 48 horas de reacção, sugerindo que a cardosina A hidrolisa o colagénio I em ligações peptídicas específicas. Foi determinado um local de clivagem para a cardosina A, trata-se da ligação peptídica F464-Q465, da cadeia α2 da molécula de colagénio I. A partir deste resultado, foram sintetizados dois péptidos com o objectivo de produzir anticorpos policlonais específicos, para posterior identificação de fragmentos de colagénio em ensaios in vitro e in vivo. A utilização destes anticorpos permitiu a identificação de quatro fragmentos resultantes da digestão, in vitro, do colagénio I pela cardosina A. A sequência Arg-Gly-Asp (RGD) está presente em sete locais distintos no colagénio I e um na cardosina A e é uma sequência de ligação característica dos tecidos animais. Neste sentido, foi testada a interacção física entre as duas moléculas e os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a sequência RGD é responsável pela ligação entre a enzima e o substrato e pode, de alguma forma, mediar a proteólise do colagénio pela cardosina A.
Postsurgical adhesion formation is an everyday problem in clinical practice, a major cause of morbidity and expense, and occasional cause of mortality. Fibrotic states are associated with excessive synthesis and deposition of connective tissue, primarily collagen, in a manner that distorts the normal architecture and compromises the function of the affected organ. Fibrillar collagen has been the subject of considerable interest because in the native state it is resistant to attack by most proteolytic enzymes. With the aim to use cardosin A to prevent clinical fibrosis and consequently adhesion formation, the action of this collagenolitic enzyme over human collagen type I has been studied. The present work shows that cardosin A, a plant aspartic proteinase is able to hydrolyse collagens inside the α-helixes. The pattern of hydrolysis of collagen type I is well defined and maintained until 48 hours of digestion, suggesting that cardosin A can hydrolyse collagen I in some specific peptide bonds. Sequencing data of hydrolysis products identified one cleavage site corresponding to F464-Q465 in the α2 chain of collagen I. According to this, two peptides were synthesised and two polyclonal antibodies were produced to identify collagen fragments following proteolytic cleavage. This probe is useful for both in vitro and in vivo studies. Four fragments of collagen digestion by cardosin A, in vitro, were detected with the produced antibodies. The Arg-Gly-Asp (RGD) sequence appears in seven different locations in collagen and one in cardosin A. The RGD motif is well known as a binding sequence in mammalian tissues. In this sense, interaction between the two molecules was tested and the results show that cardosin A is able to bind to collagen I, through this motif, and is, eventually, associated with proteolysis of collagen I by cardosin A.
URI: http://hdl.handle.net/10773/25739
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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