Estudo da biodegradação da lenhina pelo fungo Trametes versicolor

Abstract

O trabalho realizado teve como objectivo principal analisar os produtos da reacção das enzimas lenhinolíticas manganês peroxidase e lacase, do fungo Trametes versicolor, com os compostos modelo diméricos do tipo bifenilo e com a lenhina técnica ALCELL. Sintetizaram-se compostos modelo para elucidar as vias de degradação específicas da lenhina pelas enzimas lenhinolíticas. Através deste trabalho também se tentou verificar se a lenhina ALCELL pode ser biodegradada pela cultura do fungo para obter precursores de produtos de elevado valor acrescentado. A metodologia experimental envolveu cinco etapas: 1) a caracterização da lenhina ALCELL (subproduto da indústria de papel); 2) a síntese de compostos modelo diméricos do tipo bifenilo com ligação 5-5’ (desidrodivanilina, álcool desidrodivanílico e compostos diméricos de álcool desidrodivanílico monometilado e dimetilado); 3) a produção de enzimas lenhinolíticas (manganês peroxidase e lacase); 4) a reacção enzimática destas enzimas com estes compostos modelo e lenhina na presença e ausência de mediadores; e finalmente 5) a biodegradação da lenhina com este fungo. A caracterização da lenhina envolveu análise elementar, análise dos grupos funcionais (OCH3, CO, OH), determinação do peso molecular (VPO,GPC) e análise estrutural (FTIR, RMN de 1H e de 13C). Verificou-se que a lenhina ALCELL é constituída por unidades guaiacilo essencialmente eterificadas e seringilo predominantemente não eterificadas, como foi revelado por estudos de RMN. Com um grande número de grupos hidroxilo fenólicos, devido à quebra de ligações éter-fenilo, a lenhina está preferencialmente degradada mostrando a presença de fragmentos de baixo peso molecular e estruturas “condensadas”. Na produção de enzimas lenhinolíticas verificou-se que a lacase tem uma actividade máxima muito superior à apresentada pela manganês peroxidase, tendo sido difícil a produção desta última para aplicações no trabalho. A actividade da lacase durante a fermentação foi estimulada pela presença de álcool veratrílico. Fez-se ainda semipurificação e concentração da lacase. A manganês peroxidase oxidou o dímero desidrodivanilina, o dímero álcool desidrodivanílico e o polímero lenhina ALCELL. A lacase, na presença de mediador HBT, demonstrou actividade de oxidação nos compostos modelo diméricos de álcool desidrodivanílico, monometilado e dimetilado. Entretanto, o sistema lacase - HBT não foi capaz de oxidar a lenhina a compostos aromáticos monoméricos ou diméricos desejáveis, no entanto, verificou-se, por FTIR, que a lenhina sofreu oxidação pela enzima. Esta observação foi explicada pela predominância de oxidação de subunidades de lenhina, por transferência de um electrão, seguida por acoplamento de radical. Através da análise dos resultados deste trabalho propõem-se alguns mecanismos específicos de oxidação enzimática. A biodegradação da lenhina por Trametes versicolor permitiu verificar que podem obter-se produtos aromáticos interessantes (de oxidação de lenhina) usando o álcool veratrílico como mediador, sem qualquer outra fonte de carbono (glucose ou outras).

The main purpose of this work was to evaluate the reactivity of lignolytic enzymes (manganese peroxidase and laccase) isolated from the Trametes versicolor fungus with technical lignin (more specifically ALCELL) and with dimeric lignin model compounds of biphenyl type. The model compounds were synthesized in order to elucidate the specific degradation pathways of lignin by lignolytic enzymes. This work has also attempted to demonstrate the possibility of ALCELL lignin biodegradation by the fungi cultures to obtain valuable products. The experimental methodology included five steps: 1) characterization of ALCELL lignin (by-product of pulp and paper industry); 2) synthesis of dimeric model compounds of biphenyl type with 5-5’ linkage (dehydrodivanillin, dehydrodivanillyl alcohol and its monomethylated and dimethylated analogs); 3) production of lignolytic enzymes (manganese peroxidase and laccase); 4) application of lignolytic enzymes in reaction with lignin model compounds and ALCELL lignin in the presence and in the absence of mediators; and, finally, 5) lignin biodegradation with this fungus. The lignin characterization has included the elementary analysis, functional groups analysis (OCH3, CO, OH), analysis of molecular weight (VPO, GPC) and structural studies (FTIR, 1H and 13C NMR). ALCELL lignin is composed essentially by etherified guaiacyl units and by non-etherified syringyl units as revealed from NMR studies. Having a large number of phenolic hydroxyl groups, due to the cleavage of phenyl ether linkages, lignin is rather degraded showing the presence of low molecular weight fragments and “condensed” structures. During the production of lignolytic enzymes it was verified that laccase has a higher maximum activity when compared to manganese peroxidase, though the latter was difficult to produce for the application in this work. Laccase activity was stimulated during fermentation by the presence of veratryl alcohol. The semipurification and concentration of laccase was also performed. Dehydrodivanillin, dehydrodivanillyl alcohol and ALCELL lignin were oxidised by manganese peroxidase. In presence of HBT as mediator, laccase showed the oxidation activity with monomethylated and dimethyla ted dehydrodivanillyl alcohols. Meanwhile, the laccase-HBT system did not allow the oxidation of ALCELL lignin to produce desirable monomeric or dimeric aromatic compounds. However, it was verified by FTIR that lignin was oxidized by enzyme. This observation was explained by predominance of one-electron oxidation of lignin subunits followed by radical coupling. Based on the analysis of results obtained in this work, several specific oxidation pathways of enzymatic oxidation of lignin have been proposed. The biodegradation of lignin by Trametes versicolor has proved that valuable aromatic products could be produced (by lignin oxidation) using veratryl alcohol as mediator without any additional carbon source (glucose or some others).