3D bioprinting in liquid medium for the bioengineering of hybrid structures for regeneration of human tissues

Abstract

Regenerative medicine and tissue engineering have emerged as alternative methodologies for the replacement of injured tissues or organs. This new approach combines the use of natural or synthetic materials with cells in order to produce a fabric that has the same structure and functionality as the original. Different bioprinting techniques have been used to produce hydrogel structures containing cells. However, such approaches have been limited to simple 2D or three-dimensional structures (3D), since the manufacture of more complex hydrogel structures, such as branched-out blood vessels, requires a support bath in order to prevent collapse of the during the printing process. This work is based on the development of a bath with rheological properties suitable for the processing of complex hydrogel structures by 3D layer-by-layer printing. On the other hand, it is also intended that this the same bath can be photo-cross-linked after printing of the structures so that hydrogels, cross-linked by reversible processes, can be easily removed from the hydrogel bath to form perforated constructions equally attractive for the regeneration of tissues and organs since they ensure controlled transport of nutrients and oxygen. Xanthan gum has excellent rheological properties, is biocompatible and easily chemically modified by the diversity of functional groups that it presents. Thus, 3D printing of complex asymmetric structures based on alginate hydrogels in viscous solution of xanthan gum was carried out. The alginate crosslinked rapidly in the xanthan gum bath by the presence of calcium chloride, getting deposited layer to layer without causing entrainment of the lower layers, collapsing or dispersing in the bath. After printing, we were able to remove an artery with asymmetric branches and inject colored solution in each of the branches, demonstrating the successful manufacture of a complex and perforated branched network. It was also evaluated the biocompatibility of the bath by printing alginate filaments with L929 cells, after which, after 7 days in culture, high cell viability with formation of cell aggregates was observed. For the formation of a hydrogel bath, I proceeded to the chemical modification of xanthan gum incorporating in the secondary polymer chain methacrylic groups, photopolymerizable by the action of UV light. 3D printing of a tortuous alginate filament in a methacrylated xanthan gum bath followed by the bath photoreticulation process proved the possibility of combining 2 hydrogels in a single device. In addition, removal of the alginate hydrogel by EDTA lavage demonstrated the high chemical and structural stability of the xanthan gum hydrogel for the formation of perforated devices. In short, a biocompatible and easy-to-process bath has been developed successfully for 3D printing processes aimed at a variability of biomedical applications.

A medicina regenerativa e a engenharia de tecidos surgiram como metodologias alternativas para a substituição de tecidos ou órgãos lesados. Esta nova abordagem combina o uso de materiais naturais ou sintéticos com células com o objetivo de produzir um tecido que possua a mesma estrutura e funcionalidade do original. Diferentes técnicas de bioimpressão têm sido usadas para produzir estruturas de hidrogel contendo células. No entanto, essas abordagens têm sido limitadas a estruturas 2D ou tridimensionais simples (3D), uma vez que o fabrico de estruturas de hidrogel mais complexas, tal como vasos sanguíneos com contornos ramificados, requere um banho de suporte de modo a evitar o colapso da estrutura durante o processo de impressão. Este trabalho baseia-se no desenvolvimento de um banho com propriedades reológicas adequadas ao processamento de estruturas complexas de hidrogéis por impressão 3D camada a camada. Por outro lado, pretende-se ainda que esse mesmo banho possa ser fotoreticulável após a impressão das estruturas de modo a permitir que hidrogéis, reticulados por processos reversíveis, possam ser facilmente removidos do banho de hidrogel formando construções perfuradas, igualmente atrativas para a regeneração de tecidos e órgãos uma vez que asseguram o transporte controlado de nutrientes e oxigénio. A goma xantana possui excelentes propriedades reológicas, é biocompatível e de fácil modificação química pela diversidade de grupos funcionais que apresenta. Assim sendo, procedeu-se à impressão 3D de estruturas assimétricas complexas à base de hidrogéis de alginato em solução viscosa de goma xantana. O alginato reticulava rapidamente no banho de goma xantana pela presença do cloreto de cálcio, conseguindo depositar-se camada a camada sem provocar o arrastamento das camadas inferiores, colapsar ou dispersar no banho. Após impressão, conseguiu-se ainda retirar uma artéria com ramos assimétricos e injetar solução corada em cada uma das ramificações, demonstrando o fabrico bem-sucedido de uma rede ramificada complexa e perfurada. Avaliou-se ainda a biocompatibilidade do banho imprimindo filamentos de alginato com células do tipo L929, observando-se, após 7 dias em cultura, elevada viabilidade celular com formação de agregados de células. Para a formação de um banho de hidrogel, procedeu-me à modificação química da goma xantana incorporando na cadeia polimérica secundária grupos metacrílicos, fotopolimerizáveis por ação da luz UV. A impressão 3D de um filamento de alginato tortuoso num banho de goma xantana metacrilada seguido do processo de fotoreticulação do banho comprovou a possibilidade de combinar 2 hidrógeis num só dispositivo. Além disso, a remoção do hidrogel de alginato por lavagem com EDTA demonstrou a elevada estabilidade química e estrutural do hidrogel à base de goma xantana para a formação de dispositivos perfurados. Em suma, desenvolveu-se com sucesso um banho biocompatível e de fácil processamento para processos de impressão 3D direcionados para uma variabilidade de aplicações biomédicas.