Development of nanoparticles aggregates containing pharmaceuticals for application in regenerative medicine

Abstract

Chronic Inflammation and Musculoskeletal Diseases are two types of diseases with greater growth each year and already reaching a larger portions pf the population worldwide. The usual treatments, for both cases, are usually implicated in large periods of time and high associated costs. Therefore, the development of new materials that can be performed as a focal long-term drug delivery system is of great interest. In this context, the use of new pharmacological drugs through the use of natural products such as flavonoids (eg Quercetin and Naringin) appear as a promising approach. Quercetin is a flavonol naturally found in many fruits, legumes, leaves and granules and is exposed to antioxidant properties. Naringin is a naturally occurring flavone that occurs naturally in citrus fruits with bioactive in various bone disorders and may have promising in the boundary osteogenesis of stem cells. However, these flavonoids are typically hydrophobic and have low bioavailability because they are rapidly metabolized in vivo, which may limit their therapeutic use. The development of systems for drug delivery in a focused way is of great interest for a different plan of action. However the result of the operations is quite challenging and even the data are only visible were achieved In this context, this thesis focus on the development of two types of colloidal gels component compose of polymeric particles with efficient encapsulation of different types of flavonoids. For the encapsulation of Quercetin, a colloidal gel composed of anionic nanoparticles of Zein and hyaluronic acid (150.5 ± 0.7 nm) that were combine with PLGA coated in poly (ethylene) (PEI) as cationic nanoparticles (218.9 ± 2, 7 nm). These system present a high efficiency of Quercetin encapsulation (92 ± 1%) through the nanoprecipitation method. The Quercetin present in the colloidal gel had a controlled drug release profile relatively slow under physiological (pH =7 4) for the period of 20 days. The gel was afterwards put in macrophagic contact and its cytotoxicity was evaluated. The production of NO by the induction of inflammatory response by LPS and successive action of the gel with Quercetin was determined by the Method of Griess demonstrating a production of NO by macrophages. In order to improve the mechanical properties and to allow in situ fixation colloidal gels with a double crosslinking were also produced. The encapsulation of Naringin is a type of Zein nanoparticles methacrylated hyaluronic acid (155.9 ± 0.9 nm) with combinations of PLGA nanoparticles coated with poly (ethylenimine) methacrylate (PEIm) (229.7 ± 1.6 nm). This system demonstrated maximum efficiency of Naringin encapsulation (64 ± 7%) in Zein particles through the nanoprecipitation method. The release profile of the colloidal gel formed by UV crosslinking was compared to a colloidal gel formed by electrostatic crosslinking. Interestingly the methacrylated gel showed a slower release profile when compared to its predecessor. Subsequently for a pro-osteogenic consultation of this system the gel was placed in contact with human adipose tissue stem cells (ASCs). The results obtained demonstrate that the UV-crosslinked colloidal system has a greater expression of the enzyme alkaline phosphatase when compared to the pro-osteogenic or administration of enzymes in their free form. In general, double-crosslinked colloidal gels are a promising platform for the local delivery of flavonoids and demonstrate potential for the application of intelligent systems to different types of tissue damage.

A Inflamação crónica e doenças musculoesqueléticas são dois tipos de doenças com maior crescimento a cada ano e já atingem uma percentagem significativa da população mundial. Os tratamentos habituais, para ambos os casos, geralmente implicam longos períodos de tempo e alto custos associados. Portanto, é de grande interesse o desenvolvimento de novos materiais que possam funcionar como sistema de entrega de fármacos a longo prazo e no local de interesse. Neste contexto, a utilização de novas abordagens farmacológicas através da utilização de produtos naturais como os flavonoides (e.g., Quercetina e Naringina) surge como uma abordagem promissora. A Quercetina é um flavonol encontrado naturalmente em muitas frutas, legumes, folhas e grãos e é descrita como contendo propriedades antioxidantes. A Naringina é uma flavona natural que ocorre naturalmente em frutas cítricas com bioatividade descrito em vários distúrbios ósseos e capaz de promover a diferenciação osteogênica de células-estaminais. No entanto, estes flavonoides são geralmente hidrofóbicos e possuem uma baixa biodisponibilidade pois são rapidamente metabolizadas in vivo, o que tende a limitar muito o seu uso terapêutico. O desenvolvimento de sistemas para a entrega destes fármacos de uma forma focalizada é de grande interesse no contexto de doenças que estão localizados num determinado tecido ou órgão. No entanto o desenvolvimento destas plataformas é bastante desafiante e até à data apenas pequenos avanços foram conseguidos Neste contexto, esta tese foca o desenvolvimento de dois tipos de géis coloidais compostos por partículas poliméricas com capacidades de encapsulamento de diferentes tipos de flavonoides. Para o encapsulamento da Quercetina, um gel coloidal composto por nanopartículas aniónicas de Zeína e ácido hialurónico (150.5 ± 0.7 nm) que foram combinadas com partículas catiónicas de PLGA revestidas por poli(etilenimina) (PEI) (218.9 ± 2.7 nm). Estes sistemas apresentaram uma elevada eficiência de encapsulação de Quercetina (92 ± 1 %) através do método nanoprecipitação. A Quercetina presente no gel coloidal obteve uma libertação controlada seguindo um perfil relativamente lento de libertação em condições fisiológicas (pH = 7.4) ao longo de 20 dias. O gel foi posteriormente colocado em contato macrófagos e a sua citotoxicidade foi avaliada. A produção de NO pela indução de resposta inflamatória por LPS e sucessiva ação do gel com Quercetina foi determinada pelo método de Griess que demonstrou uma diminuição da produção de NO por parte dos macrófagos. Por forma a melhorar as propriedades mecânicas e permitir a fixação in situ foram também produzidos géis coloidais com uma dupla reticulação. Para o encapsulamento de Naringina um tipo diferente de nanopartículas de Zeína ácido hialurónico metacrilado (155.9 ± 0.9 nm) foram combinadas com as partículas PLGA revestidas por poli(etilenimina) metacrilada (PEIm) (229.7 ± 1.6 nm). Este sistema demonstrou uma elevada eficiência de encapsulação Naringina (64 ± 7 %) em partículas de Zeína através do método nanoprecipitação. O perfil de libertação do gel coloidal formado por reticulação UV foi comparado com um gel coloidal formado por reticulação electroestática. Interessantemente o gel metacrilado demonstrou um perfil de libertação mais lento quando comparado com o seu antecessor. Posteriormente para avaliar a atividade pró-osteogénica deste sistema o gel foi colocado em contato com células-estaminais de tecido adiposo humano (ASCs). Os resultados obtidos demonstraram que o sistema coloidal reticulado por UV induz uma maior expressão da enzima alcalina fosfatase quando comparado com o meio pro-osteogénico ou a administração de Naringina na sua forma livre. No geral, os géis coloidais de dupla reticulação apresentam-se como uma promissora plataforma para entrega local de flavonoides e demonstraram potencial para futuras aplicação como sistemas moldáveis aos diferentes tipos de danos tecidulares.