Desenvolvimento e validação de um método analítico multi-substâncias por GC-MS, em sangue total, com fins forenses

Abstract

A necessidade de metodologias analíticas que permitam a interpretação de situações de morte associadas a substâncias tóxicas, e a avaliação de estados de dependência, promoveu o desenvolvimento de técnicas sofisticadas para detetar e quantificar drogas de abuso (DA) em amostras biológicas. Hoje em dia, é frequente o consumo de várias substâncias psicotrópicas em simultâneo, pelo que se torna imperativo que os métodos criados abranjam analitos de várias classes de DA, os chamados métodos multi-drug. Por continuar a ser a técnica mais bem implementada atualmente nos laboratórios de toxicologia forense (TF), o desenvolvimento de métodos que incluem a GC-MS continua a observar-se, ainda que em menor número do que o verificado para outras técnicas, como a cromatografia líquida (LC). Neste trabalho, depois de uma revisão da literatura relevante para esta problemática, apresenta-se o processo de desenvolvimento e de validação de um método SPE-GC-MS que deteta compostos pertencentes ao grupo da cocaína e seus metabolitos, dos opiáceos e das novas substâncias psicoativas (NPS), visto que o seu consumo recreativo tem aumentado nos últimos anos e o poli-consumo destas DA é muito comum. Com a análise por GC-MS, em modo de varrimento, das DA alvo em forma de padrões puros após sililação (BSTFA:1%TMCS), selecionaram-se os iões de diagnóstico das DA e dos respetivos padrões internos e determinaram-se os tempos de retenção. Seguidamente, efetuou-se a validação do método proposto através da avaliação de diversos parâmetros pelo modo SIM. Este método revelou-se específico/seletivo para as 23 DA. Devido às diferentes janelas terapêuticas, tóxicas e letais dos analitos, estabeleceram-se 3 gamas de trabalho para 3 painéis (painéis 1, 2 e 3) onde se distribuíram as DA de acordo com esses intervalos. Comprovou-se a linearidade das gamas de trabalho definidas para todas as DA. com exceção da pseudoefedrina, da efedrina, da norefedrina e do TFMPP. Os restantes 19 compostos demonstraram heterocedasticidade, pelo que se estudaram 6 fatores de ponderação (w) através do estabelecimento de uma ordenação final, aferida com base nos parâmetros de r2 médio, Ʃ%RE, limite de repetibilidade e incerteza expandida. O w com melhor posição na ordenação final foi selecionado para a respetiva DA, tendo-se escolhido para a maioria dos compostos os fatores 1/y1/2 e 1/x2. Os LD estabelecidos foram 25, 2 e 10 ng/mL para os painéis 1, 2 e 3 respetivamente. Para a pseudoefedrina e a efedrina o LD foi de 25 ng/mL, e para a norefedrina e o TFMPP o LD foi de 50 ng/mL, funcionando o método apenas para rastreio destas DA. O LIQ das 19 DA quantificáveis corresponde ao nível mais baixo de cada gama de trabalho. Não se observaram fenómenos de arrastamento para nenhum dos analitos e o rendimento de extração das DA variou, maioritariamente, entre 62,07% e 97,14%. A EDDP e a buprenorfina obtiveram rendimento inferior a 50% mas que ainda assim permitiu detetar e identificar estes analitos dentro das gamas pretendidas. Por outro lado, o d-propoxifeno e a 3-MeO-PCP revelaram rendimentos superiores a 100%, mas dentro de valores aceitáveis (até 120%). Apenas o N-DT revelou rendimento superior a 120%. Em termos de precisão e exatidão, estabeleceu-se um limite de repetibilidade entre 28,48% e 58,14% para a cetamina, a buprenorfina, o fentanilo, a EME, a petidina e o N-DT e 25% para as restantes substâncias. Os valores de incerteza expandida combinada variaram entre 25,02% e 76,66%. O cumprimento dos critérios de aceitação de validação em vigor no SQTF-N, estabelecidos de acordo com as normas internacionais para TF, demonstra a validade do método proposto, viabilizando a sua aplicação à rotina laboratorial do serviço. Tal reduzirá substancialmente os tempos de resposta e os custos de cada análise realizada.

The need of analytical methods that allow an interpretation of toxic-related death situations and the assessment of influence states promote the development of sophisticated techniques for the detection and quantification of drugs of abuse (DA) in biological samples. Nowadays, it is frequent the simultaneous consumption of several psychotropic substances, so it is imperative that developed methodologies cover analytes of several classes of DA, the so-called multi-drug methods. As it continues to be the best-implemented technique in clinical and forensic toxicology (FT) labs, the development of methods that include GC-MS continues to be pursued, although in a smaller number than other techniques, such as liquid chromatography (LC). In this work, after a review contextualizing the problem, we will present the development and validation process of an SPE-GC-MS analytical method that detects compounds belonging to the DA groups of cocaine and metabolites, opiates and new psychoactive substances (NPS), since it’s recreative consumption has increased in the last years, and poly-consumption of these DA is very common. With the GC-MS SCAN mode analysis of targeted DA as purified standards after silylation (BSTFA:1%TMCS), the diagnostic ions of the DA and it’s internal standards were chosen, as well as the retention times of each one. After that, validation of the proposed method was followed, through the evaluation of several parameters in SIM mode. The method revealed itself as specific/selective for the 23 DA. Due to different therapeutic, toxic and lethal concentrations, 3 work ranges were defined to 3 sets where DA were distributed according to those concentrations. Linearity was verified for the defined work ranges of all DA, except for pseudoephedrine, ephedrine, norephedrine, and TFMPP. The remaining 19 substances revealed heteroscedasticity, so 6 ponderation factors (w) were studied through a final ranking established from medium r2, Ʃ%RE, repeatability limit, and expanded uncertainty. The best-positioned w was selected for the corresponding DA, which corresponded to 1/y1/2 e 1/x2 for most of the compounds. Established LD were 25, 2 and 10 ng/mL for sets 1, 2 and 3, respectively. For pseudoephedrine and ephedrine, the LD was 25 ng/mL, and for norephedrine and TFMPP, the LD was 50 ng/mL. As so, the method will be used only to screen these DA. The LLQ of the 19 quantifiable compounds corresponds to the lower level of each working range. No carryover was observed to any of the analytes, and the extraction recovery of DA varied mostly between 62,07% e 97,14%. EDDP and buprenorphine had an extraction recovery smaller than 50%, but it still allowed to detect and quantify these analytes within the working range. On the other hand, d-propoxyphene and 3-MeO-PCP had extraction recoveries over 100%, but within acceptable values (120%). Only N-DT had an extraction recovery over 120%. In terms of precision and accuracy, it was established a repeatability limit between 28,48% and 58,14% for ketamine, buprenorphine, fentanyl, EME, pethidine and N-DT, and 25% for the remaining substances. The expanded uncertainty values ranged from 25,02% to 76,66%. The achievement of all the validation criteria established at SQTF-N according to the international guidelines for FT demonstrates the validity of the proposed method, allowing it’s application to the service lab’s routine. This will substantially reduce the waiting times and the costs of each performed analysis.