Microbial fermentation of glycerol for production of value-added compounds under high pressure

Abstract

Microbial conversion of glycerol into value-added products constitutes a promising approach to dispose the excess glycerol generated by the biodiesel industry. A possible strategy to improve these processes is the performance of fermentations under sub-lethal high pressure (HP), which may stimulate cell growth and/or increase fermentation rates and yields. Therefore, the goal of the present work was to study the application of HP (in the range of 10 to 50 MPa) on two different microbial processes: one of them with Lactobacillus reuteri, which is able to produce 1,3-propanediol from glycerol; and the other with Paracoccus denitrificans, which is able to produce polyhydroxyalkanoates from glycerol. In the case of L. reuteri fermentation, the production of 1,3-propanediol was stimulated at 10 MPa, resulting in yield and productivity improvements of ≈ 11 and 12 %, respectively, relatively to the same samples at atmospheric pressure. Adaptation of L. reuteri to pressure was assessed during four consecutive fermentation cycles. After the fourth cycle at 10 MPa, 1,3-propanediol titers increased 15 % relative to the respective cycle at atmospheric pressure, and even more (52 %) relative to the “conventional approach”, i.e. without the fermentation cycles, at atmospheric pressure. These results confirm that different strategies of HP application may stimulate the production of 1,3-propanediol. To better understand the effects of these HP-cycles on the L. reuteri metabolism, a comparative metabolomic study between L. reuteri fermentation samples was performed. The results showed distinct metabolic profiles according to the pressure applied and the fermentation cycles. The adaptive effect throughout the cycles was considerably more accentuated at 10 MPa. These results unveil relevant information regarding the adaptation of lactic acid bacteria to sub-lethal HP. Regarding glycerol fermentation by P. denitrificans, it was necessary to give special focus on air availability, since this is a critical parameter that affects cell growth and metabolic profile, and it may be limited during fermentation under HP conditions. Samples with higher air availability showed considerable cell growth, but no production of ethanol, acetate and succinate. On the other hand, samples without air had lower cell growth, but active metabolic activity (with the production of organic acids and ethanol). Regarding the experiments of fermentation under HP, P. denitrificans was able to grow at 10, 25 and 35 MPa, but at lower extent compared to atmospheric pressure. Application of HP promoted modifications in the P. denitrificans fermentative profiles at different pressure levels. In addition, HP was found to affect polyhydroxyalkanoate production, resulting in lower titers, but higher polymer content in cell dry mass (%), which indicates higher ability to accumulate these polymers in the cells. Some levels of HP also affected PHA monomeric composition, showing considerable differences relative to the ones obtained at atmospheric pressure. It is possible to foresee that these changes in polymer composition may also affect its physical and mechanical properties.

A conversão microbiana de glicerol em compostos de valor-acrescentado constitui uma aplicação promissora para o excesso de glicerol gerado pela indústria do biodiesel. Uma possível estratégia para melhorar estes processos passa pelo uso de níveis sub-letais de Alta Pressão (AP) ao longo da fermentação, de modo a estimular o crescimento dos microrganismos fermentativos e/ou aumentar a velocidade e os rendimentos do processo. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da aplicação de AP (entre 10 e 50 MPa) em dois processos fermentativos: um deles com a Lactobacillus reuteri, que produz 1,3-propanediol a partir de glicerol; e outro com a Paracoccus denitrificans, que produz polihidroxialcanoatos a partir de glicerol. No caso da fermentação com a L. reuteri, a produção de 1,3-propanediol foi estimulada a 10 MPa, resultando em aumentos de rendimento e produtividade de ≈ 11 e 12 %, respetivamente, relativamente às amostras à pressão atmosférica. A adaptação da L. reuteri à pressão foi ainda avaliada durante quatro ciclos de fermentação consecutivos. Após o quarto ciclo a 10 MPa, a concentração de 1,3-propanediol aumentou 15 % relativamente ao respetivo ciclo à pressão atmosférica, e ainda mais (52 %) relativamente à “abordagem convencional”, i.e. sem os ciclos de fermentação, à pressão atmosférica. Estes resultados confirmam que diferentes estratégias de aplicação de AP podem aumentar a produção de 1,3-propanediol. De modo a compreender os efeitos dos ciclos de pressão no metabolismo da L. reuteri, realizou-se um estudo metabolómico comparativo entre amostras de fermentação a diferentes condições. Foram observados perfis metabólicos distintos de acordo com a pressão aplicada e com o ciclo fermentativo, sendo que o efeito adaptativo ao longo dos ciclos foi mais acentuado a 10 MPa. Estes resultados fornecem informação relevante relativa à adaptação de bactérias ácido-láticas a pressões sub-letais. Numa fase inicial do estudo da fermentação de glicerol pela P. denitrificans, analisou-se o efeito da disponibilidade de ar no processo, uma vez que este corresponde a um parâmetro crítico que afeta o crescimento celular e o perfil metabólico deste microrganismo, e poderá ser limitado durante a fermentação sob pressão. De facto, amostras com elevada disponibilidade de ar mostraram crescimento celular considerável, mas ausência de produção de etanol ou ácidos orgânicos. Por outro lado, amostras sem ar mostraram reduzido crescimento celular, mas atividade metabólica ativa, com produção de etanol, succinato e acetato. Relativamente ao estudo do efeito da pressão, a P. denitrificans mostrou capacidade para crescer a 10, 25 e 35 MPa, ainda que não tão acentuadamente quanto à pressão atmosférica. O uso da AP promoveu alterações nos perfis fermentativos da P. denitrificans. Para além disso, a AP afetou a produção de polihidroxialcanoatos, resultando em concentrações de polímero mais baixas, mas conteúdos de polímero em biomassa (%) superiores, o que indica uma maior capacidade de acumular este composto no interior das células. Sob determinados níveis de pressão, os polímeros formados apresentaram modificações na sua composição monomérica, relativamente aos obtidos à pressão atmosférica. É possível antever que estas alterações poderão afetar as propriedades físicas e mecânicas do polímero. Em suma, o presente trabalho revelou diferentes caraterísticas metabólicas da L. reuteri e da P. denitrificans. Os resultados obtidos mostraram ainda que, quando aplicada em condições adequadas, a tecnologia de AP poderá apresentar-se como uma ferramenta útil para modificar e até melhorar processos de fermentação de glicerol, bem como os respetivos produtos. Este estudo abre também os horizontes para o uso desta tecnologia no estímulo de outros processos fermentativos que sejam relevantes para a indústria biotecnológica.