Flavonoid-mediated modulation at human macrophages phospholipidome : an LC-MS lipidomics study

Abstract

Macrophages are innate immune cells deeply involved in inflammation. Inflammatory signalling and macrophage lipid composition are closely related, underlying the relevance of characterising lipid alterations accompanying macrophage phenotypic and functional spectrum. Several flavonoids are recognized for their anti-inflammatory activity, although little is known about their effects towards macrophage lipid composition and metabolism. In this work, we have employed a lipidomics approach based on liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis of cellular lipid extracts to characterize the alterations in the phospholipidome of human macrophages (differentiated from THP-1 monocytes) in response to three flavonoids: quercetin (Que), naringin (Nar) and naringenin (Ngn). Macrophages stimulated with LPS/IFN-γ (M1) and IL-4/IL-13 (M2) were also profiled for comparison. This study enabled the identification and relative quantification of 147 phospholipids (PL) belonging to 8 different classes: phosphatidylcholines (PC), phosphatidylethanolamines (PE), lysophosphatidylcholines (LPC), lysophosphatidylethanolamines (LPE), phosphatidylglycerols (PG), phosphatidylinositols (PI), phosphatidylserines (PS) and sphingomyelins (SM). All flavonoids were seen to have a pronounced impact on the macrophage phospholipidome, causing large magnitude variations in 47-76% of all identified PL species. By comparing the most prominent effects of the three flavonoids on M1 pre-polarized macrophages, it was found that flavonoid-mediated lipid remodelling was generally characterized by increases in LPC, LPE and PG species, accompanied by decreases in choline plasmalogens and SM species, whereas the modulation of other PL species was clearly flavonoid-dependent. Overall, quercetin and naringenin shared the greatest similarity. Although it was not possible to attribute individual variations to specific biological functions, it could be concluded that flavonoids affected cell membrane composition and properties, cell signalling and communication, and, possibly, antioxidant activity. Interestingly, two species emerged as potential anti-inflammatory lipid markers of flavonoid activity, PC(32:0) and PE(O-36:6)/PE(P-36:5), decreasing in response to either M2 polarization and flavonoid treatment. Their anti-inflammatory activity and relevance to macrophage biology (e.g., membrane fluidity, production of cytokines, phagocytic capacity) should be explored in future studies. Overall, this work has shown that human macrophage phospholipidome is exquisitely sensitive to flavonoid treatment, opening new research perspectives towards a greater understanding of the interplay between flavonoid-induced PL modulation and macrophage inflammatory responses.

Os macrófagos são células do sistema imune inato com grande envolvimento na resposta inflamatória. A sinalização inflamatória e o metabolismo lipídico estão fortemente interligados, pelo que a caracterização das alterações lipídicas que acompanham o espetro fenotípico e funcional dos macrófagos é especialmente relevante. Vários flavonoides são conhecidos pela sua atividade anti-inflamatória, no entanto, pouco se sabe acerca do seu efeito na composição e metabolismo lipídicos. Neste trabalho, utilizámos uma abordagem lipidómica baseada na análise por cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa (LC-MS) de extratos celulares lipídicos, para caracterizar as alterações no fosfolipidoma de macrófagos humanos (diferenciados a partir de monócitos THP-1) em resposta a três flavonoides: quercetina (Que), naringina (Nar) e naringenina (Ngn). Para efeitos de comparação, foram ainda analisados macrófagos estimulados com LPS/IFN-γ (M1) e IL-4/IL-13 (M2). Este estudo permitiu a identificação de 147 fosfolípidos pertencentes a 8 classes diferentes: fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), lisofosfatidilcolinas (LPC), lisofosfatidiletanolaminas (LPE), fosfatidilgliceróis (PG), fosfatidilinositóis (PI), fosfatidilserinas (PS) e esfingomielinas (SM). Todos os flavonoides tiveram um impacto pronunciado no fosfolipidoma dos macrófagos, provocando variações de grande magnitude em 47-76% de todas as espécies identificadas. Comparando os efeitos mais proeminentes em macrófagos pré-polarizados para M1, verificou-se que a remodelação lipídica induzida pelos flavonoides incluiu aumentos em espécies de LPC, LPE e PG, e diminuições em espécies de SM e plasmalogénios de colina, ao passo que a modulação das outras classes de PL foi claramente diferente para cada flavonoide. No geral, o maior grau de semelhança nos efeitos produzidos foi visto entre a quercetina e a naringenina. Embora não podendo atribuir variações individuais a funções biológicas específicas, foi possível concluir que os três flavonoides afetaram a composição e propriedades das membranas, a sinalização e comunicação celulares e, possivelmente, a atividade antioxidante. Interessantemente, duas espécies emergiram como potenciais marcadores lipídicos da ação anti-inflamatória mediada por flavonoides: PC(32:0) e PE(O-36:6)/PE(P:36:5), decrescendo ambas em resposta à polarização M2 e a qualquer um dos flavonoides. A sua atividade anti-inflamatória e a sua relevância para aspetos da biologia dos macrófagos (por ex., fluidez membranar, produção de citocinas, capacidade fagocítica) deverão ser investigadas em estudos futuros. Em suma, este trabalho demonstrou que o fosfolipidoma de macrófagos humanos é extremamente sensível ao tratamento com flavonoides, abrindo novas perspetivas de investigação rumo a uma melhor compreensão da interligação entre a modulação lipídica mediada por flavonoides e a resposta inflamatória dos macrófagos.