Development of rapid methods for the detection of pathogenic microorganisms, based on NAM-FISH technology

Abstract

The access of pathogenic microorganisms to the human body can compromise the health of the individual, causing several clinical manifestations. Helicobacter pylori and Campylobacter are two important gastrointestinal pathogens. H. pylori infection is one of the most common human infections, whose treatment includes the administration of antibiotics, namely fluoroquinolones (FQ). However, there has been an increasing resistance of H. pylori to FQ, which can lead to treatment failures, making it important not only to detect the bacterium but also to define its resistance profile. Campylobacter is currently considered the leading cause of bacterial foodborne illnesses, usually associated with the consumption of raw meat. The detection of pathogenic microorganisms can be achieved by conventional culture techniques or by molecular methods, namely immunological tests or nucleic acid detection. Biomode is an innovative company that develops and commercializes rapid diagnostic methods based on Nucleic Acid Mimic (NAM) – fluorescence in situ hybridization (FISH) technology, which enables the rapid detection of microorganisms, through the hybridization of complementary fluorescent probes with specific sequences present in the target microorganism. In this context, the present work focused on two applications of NAM-FISH. In the clinical area, the main objective was the development of a method for the detection of H. pylori and its resistance to FQ. For this purpose, Peptide Nucleic Acid (PNA) and Locked Nucleic Acid (LNA)/2'OMe probes were designed for the detection of mutations that cause resistance. In order to cover the most prevalent mutations, as well as the wildtype phenotype, 5 LNA/2'OMe probes were selected. In the area of food safety, the objective was the optimization of a PNA-FISH method for Campylobacter detection in food samples. A preliminary testing of the inclusivity/exclusivity of the Campylobacter probe resulted in the detection of two non-target microorganisms, H. cinaedi and H. pamatensis. To optimize the procedure, samples of raw broiler meat inoculated artificially with C. jejuni were used. Prior to PNA -FISH, a new step was introduced in which the enriched samples are subjected to a centrifugation (10 000 g), followed by resuspension in 0.1% Triton X-100, in order to reduce the strong autofluorescence shown in samples without any treatment. The possibility of a two-step sample enrichment was also tested, however, this approach did not show advantages compared to the one-step procedure. Additionally, a robustness test, required by the AOAC International to obtain product certification, was performed, which showed that the variation of the parameters of the time and temperature of hybridization influence the performance of the method, showing that the PNA-FISH conditions must be strictly controlled. The results obtained in this study showed that the PNA-FISH method is suitable for the rapid detection of Campylobacter in food samples. With this work, it is concluded that although the two NAM-FISH based methods are a promising alternative for the detection of H. pylori and Campylobacter, they both require optimization.

O acesso de microrganismos patogénicos ao corpo humano pode comprometer a saúde do indivíduo, provocando variadas manifestações clínicas. Helicobacter pylori e Campylobacter são dois importantes patógenos gastrointestinais. A infeção por H. pylori é uma das infeções humanas mais comuns, cujo tratamento inclui a administração de antibióticos, nomeadamente fluoroquinolonas (FQ). Contudo, tem-se verificado um aumento da resistência de H. pylori a FQ, o que pode resultar em falhas no tratamento, tornando-se importante não só a deteção da bactéria, mas também a definição do seu perfil de resistência. Campylobacter é atualmente considerada a principal causa de doenças transmitidas por alimentos, encontrando-se normalmente associada ao consumo de carne crua. A deteção de microrganismos patogénicos pode ser alcançada por técnicas de cultura convencionais ou por métodos moleculares, nomeadamente testes imunológicos ou de deteção de ácidos nucleicos. A Biomode é uma empresa inovadora que desenvolve e comercializa métodos de diagnóstico rápidos baseados na tecnologia de hibridação fluorescente in situ (FISH) de ácidos nucleicos mímicos (NAM), NAM-FISH, que possibilita a deteção rápida de microrganismos, através da hibridação de sondas fluorescentes complementares com sequências específicas presentes no microrganismo alvo. Neste contexto, o presente trabalho teve como foco duas aplicações do NAM-FISH. Na área clínica, o objetivo principal foi o desenvolvimento de um método para a deteção de H. pylori e da resistência a FQ. Para tal, procedeu-se ao desenho de sondas de Peptide Nucleic Acid (PNA) e Locked Nucleic Acid (LNA)/2’OMe para a deteção de mutações causadoras da resistência. De forma a cobrir as mutações mais prevalentes, bem como o fenótipo wild-type, foram selecionadas 5 sondas de LNA/2’OMe. Na área da segurança alimentar, foi objetivo a otimização de um método de PNA-FISH para a deteção de Campylobacter em amostras alimentares. Um ensaio preliminar da inclusividade/exclusividade da sonda Campylobacter resultou na deteção de dois microrganismos não-alvo, H. cinaedi e H. pamatensis. Para a otimização do procedimento, foram utilizadas amostras de carne de frango crua, inoculadas artificialmente com C. jejuni. Antes do PNAFISH, foi introduzido um novo passo, no qual as amostras enriquecidas são sujeitas a uma centrifugação (10 000 g), seguida de ressuspensão em 0.1% Triton X-100, com o objetivo de reduzir a autofluorescência forte visualizada em amostras sem qualquer tratamento. Testou-se também a possibilidade de um enriquecimento das amostras em dois passos, no entanto, esta abordagem não demonstrou vantagens comparativamente ao procedimento em um passo. Efetuou-se ainda um teste de robustez, requerido pela AOAC International para a obtenção de certificação de produto, que revelou que a variação dos parâmetros do tempo e temperatura de hibridação influenciam a performance do método, pelo que as condições do PNA-FISH devem ser rigorosamente controladas. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que o método PNAFISH é adequado para a rápida deteção de Campylobacter em amostras alimentares. Com este trabalho conclui-se que, embora os dois métodos baseados em NAM-FISH sejam uma opção promissora para a deteção de H. pylori e Campylobacter, ambos necessitam de otimização futura.