Characterization of peripheral blood lymphocytes in juvenile idiopathic arthritis

Abstract

Juvenile idiopathic arthritis is the most common rheumatic condition in children. Disturbances in adaptive immune responses have been implicated in JIA development. Previous reports have demonstrated that activated T cells are found at increased levels not only in circulation, but also locally in the joints of JIA patients. B cells can also have several important roles in JIA pathogenesis such as autoantibody production, antigen presentation and/ or T cell activation. Recently, it has been described that the majority of polyarticular juvenile idiopathic arthritis (pJIA) and a large fraction of extended oligoarticular JIA (oJIA) patients fulfil classification criteria for rheumatoid arthritis (RA) in adulthood. B and T cells play several important roles in RA pathogenesis, but it is still unclear if the pattern of B and T cell involvement in pJIA and extended oJIA follows what has been described for adults with RA. Therefore, the main goal of this study was to perform a phenotypic and functional characterization of circulating B and T cells in peripheral blood from children with pJIA and extended oJIA when compared to adult JIA (AJIA), early untreated RA (ERA) and established treated RA patients in order to clarify the role of these cells in the pathogenesis of inflammatory arthritis in children. For that, blood samples were collected from children (n=22) and adults (n=8) diagnosed with pJIA and extended oJIA, early untreated RA (ERA) with less than one year of disease duration (n=12), established RA patients treated with synthetic disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) (n=10) and two corresponding groups of age- and sex-matched healthy donors. An extensive characterization of B and T cell phenotype was performed by flow cytometry and in vitro B and T cell apoptosis was assessed after 48 hours of cell culture. Additionally, the serum levels of B cell activating factor (BAFF). A proliferation-inducing ligand (APRIL), interleukin (IL)-6 and IL-21 were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in all groups. It was found that children with JIA had similar CD19+ B cell levels in circulation when compared to healthy controls, AJIA and ERA patients, but significantly higher CD19+ B cell frequencies in comparison to established RA. In addition, increased frequencies of transitional (IgD+CD38++) and naïve (IgD+CD27+) B cell subpopulations were observed in children with JIA when compared to established RA patients. However, established RA patients had significantly higher levels of post-switch (IgD-CD27+) and IgD-CD27- memory B cell subsets when compared not only to controls, but also to children with JIA. No significant differences were detected in pre-switch (IgD+CD27+) memory, plasmablasts (IgD-CD38++) and CD21lowCD38low B cell levels in children with JIA when compared to controls, AJIA, ERA and established RA patients. Furthermore, the frequency of CD5+ B cells, CD5 median fluorescence intensity (MFI), CD21 MFI and CD38 MFI B cell expression levels were significantly increased in children with JIA when compared to established RA, but not to controls, AJIA or ERA. CD23, CD86, CD95 and RANKL MFI B cell expression levels were significantly decreased in children with JIA when compared to ERA patients, but no significant differences were observed when compared to healthy controls, AJIA and established RA. No significant differences were found in BAFF-R, CXCR5, CD40, FcgRIIB, HLA-DR and TLR9 B cell expression levels in children with JIA when compared to all groups. Regarding T cells, no significant differences were observed in the frequency of total CD3+ T cells and CD3+CD4+ T cells in children with JIA when compared to all groups. However, CD3+CD8+ T cells in circulation were significantly increased in children with JIA when compared to controls. It was also observed that the frequency of naïve T cells (CD3+CD4+CD45RO- and CD3+CD8+CD45RO-) was significantly increased in children with JIA when compared to ERA and established RA patients, but not to AJIA or controls. Nevertheless, the frequency of memory T cells (CD3+CD4+CD45RO+ and CD3+CD8+CD45RO+) was significantly decreased in children with JIA when compared to ERA and established RA patients, but not to AJIA or controls. In addition, HLA-DR and CD40L MFI T cell expression levels were significantly decreased in children with JIA when compared to ERA and established RA, but not to controls or AJIA. After 48 hours of in vitro cell culture, higher B and T cell death rates were found in all groups when compared to baseline, but no significant differences were detected between groups. Children with JIA had significantly increased BAFF and IL-6, but not APRIL and IL-21 serum levels when compared to healthy controls. Moreover, ERA and established RA patients, but not AJIA patients, had significantly higher APRIL, IL-6 and IL-21 serum levels when compared to children with JIA. In conclusion, the increased frequencies of transitional B cells, naïve (B and T cells) and CD5+ B cells in circulation and reduced levels of memory B and T cell subpopulations in children with JIA when compared to ERA and established RA are probably related to an immature immune system present in children when compared to adults. Nevertheless, the alterations in B and T cell phenotype found in children with oJIA and pJIA when compared to adult patients (AJIA, ERA and established RA) suggests an early B and T cell involvement in the pathogenesis of these two categories of JIA.

A artrite idiopática juvenil (AIJ) é a doença reumática mais comum em crianças. Estudos anteriores demonstraram que alterações no sistema imunitário adaptativo estão implicadas no desenvolvimento da AIJ. De facto, foram descritas frequências aumentadas de linfócitos T activados quer em circulação, quer nas articulações de doentes com AIJ. Os linfócitos B também desempenham importantes papéis na patogénese da AIJ, nomeadamente a nível da produção de autoanticorpos, apresentação de antigénios e / ou activação de linfócitos T. Recentemente, foi descrito que a maioria dos doentes com os subtipos de AIJ poliarticular e oligoarticular estendida apresentam critérios de classificação de artrite reumatóide (AR) na fase adulta. Os linfócitos B e T têm importantes funções na patogénese da AR, mas desconhece-se actualmente se o padrão de envolvimento destas células nos subtipos de AIJ poliarticular e oligoarticular estendida é ou não semelhante ao que está descrito na literatura em adultos com AR. Deste modo, o principal objectivo deste estudo foi efectuar uma caracterização fenotípica e funcional dos linfócitos B e T de sangue periférico de crianças com AIJ poliarticular e oligoarticular estendida em comparação com adultos com AIJ e doentes com AR inicial não tratada e AR estabelecida para clarificar o papel destas células no desenvolvimento da artrite em crianças. Para tal, foram colhidas amostras de sangue a crianças (n=22) e adultos (n=8) diagnosticados com AIJ poliarticular e oligoarticular estendida, AR inicial não tratada com menos de um ano de duração de doença (n=12), AR estabelecida sob tratamento com drogas antirreumáticas modificadoras de doença (n=10) e dois grupos de controlos saudáveis (crianças e adultos) com idade e género comparáveis. Procedeu-se a uma extensa caracterização fenotípica dos linfócitos B e T por citometria de fluxo e foi analisada a apoptose dos linfócitos B e T após 48 horas de cultura celular in vitro. Além disso, quantificaram-se os níveis séricos das citocinas B cell activating factor (BAFF), A proliferation-inducing ligand (APRIL) e das interleucinas (IL)-6 e IL-21 por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) em todas as amostras. significativamente mais elevadas quando comparadas com doentes com AR estabelecida. Verificou-se ainda um aumento em circulação das subpopulações de linfócitos B de transição (IgD+CD38++) e naïve (IgD+CD27+) nas crianças com AIJ em comparação com doentes com AR estabelecida. Contudo, os doentes com AR estabelecida apresentaram níveis aumentados das subpopulações de linfócitos B memória post-switch (IgD-CD27+) e IgD-CD27- em circulação quando comparados com os controlos saudáveis e crianças com AIJ. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas nas frequências das subpopulações de linfócitos B memória pre-switch (IgD+CD27+), plasmócitos (IgD-CD38++) e CD21lowCD38low nas crianças com AIJ em comparação com controlos, adultos com AIJ, AR inicial e AR estabelecida. Adicionalmente, verificou-se que a frequência de linfócitos B CD5+ em circulação e os valores da intensidade mediana de fluorescência (MFI) de CD5, CD21 e CD38 expressos pelos linfócitos B estavam significativamente aumentados nas crianças com AIJ quando comparadas com doentes com AR estabelecida, mas não com os controlos, adultos com AIJ ou AR inicial. Os valores de MFI de CD23, CD86, CD95 e RANKL expressos pelos linfócitos B estavam significativamente reduzidos nas crianças com AIJ quando comparadas com doentes com AR inicial, mas não se observaram diferenças significativas em comparação com os controlos, adultos com AIJ e AR estabelecida. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas na expressão dos marcadores celulares BAFF-R, CXCR5, CD40, FcgRIIB, HLA-DR e TLR9 nos linfócitos B das crianças com AIJ quando comparadas com todos os grupos. Relativamente aos linfócitos T, não se observaram diferenças estatisticamente significativas na frequência dos linfócitos T totais CD3+ e linfócitos T CD3+CD4+ em circulação nas crianças com AIJ em comparação com todos os grupos. Contudo, a frequência dos linfócitos T CD3+CD8+ em circulação estava significativamente aumentada nas crianças com AIJ quando comparadas com os controlos. Observou-se ainda que a frequência dos linfócitos T naïve (CD3+CD4+CD45RO- e CD3+CD8+CD45RO-) estava significativamente aumentada nas crianças com AIJ em comparação com os doentes com AR inicial e AR estabelecida, mas não com os adultos com AIJ, ou controlos. No entanto, a frequência dos linfócitos T memória (CD3+CD4+CD45RO+ and CD3+CD8+CD45RO+) estava significativamente diminuída nas crianças com AIJ em comparação com os doentes com AR inicial e AR estabelecida, mas não com os adultos com AIJ, ou controlos. Verificou-se ainda que a expressão (MFI) de HLA-DR e CD40L nos linfócitos T estava significativamente reduzida nas crianças com AIJ em comparação com os doentes com AR inicial e AR estabelecida, mas não com os adultos com AIJ, ou controlos. Após 48 horas de cultura celular in vitro, observou-se uma maior taxa de apoptose nos linfócitos B e T em todos os grupos analisados em comparação com as 0 horas, mas não foram detectadas diferenças significativas entre grupos. Os níveis séricos de BAFF e IL-6, mas não de APRIL e IL-21, estavam significativamente aumentados nas crianças com AIJ quando comparadas com os controlos saudáveis.Observou-se ainda que os doentes com AR inicial e AR estabelecida, mas não os adultos com AIJ, apresentaram níveis significativamente elevados de APRIL, IL-6 e IL-21 no soro em comparação com os controlos. Em conclusão, as frequências aumentadas de linfócitos B de transição, naïve (linfócitos B e T) e linfócitos B CD5+ em circulação e os níveis reduzidos de subpopulações de linfócitos B e T de memória no sangue periférico das crianças com AIJ quando comparadas com os doentes com AR inicial e AR estabelecida estarão provavelmente relacionadas com a imaturidade do sistema imunitário presente nas crianças em comparação com os adultos. No entanto, as alterações encontradas no fenótipo dos linfócitos B e T nas crianças com AIJ poliarticular e oligoarticular estendida quando comparadas com os doentes adultos com AIJ, AR inicial e AR estabelecida sugerem uma intervenção precoce dos linfócitos B e T no desenvolvimento e patogénese destes dois subtipos de AIJ desde a fase juvenil da doença.