Several aspects of Planctomycetes biology

Abstract

The phylum Planctomycetes harbours members with uncommon characteristics among bacteria such as membrane coat-like proteins, synthesis of sterol and a new uncharacterized mechanism of macromolecule uptake, that render them relevant in the study of different areas of knowledge. To further understand the machineries behind these unique characteristics, molecular studies have recently begun to appear. In silico analysis of Planctomycetes genomes has provided the identification of several giant genes with more than 15 kb, but the function of their products is still unknown. In the present study, a triparental mating protocol was developed and conducted in order to assess the function of one of those giant genes (the UC8_04175 Matrixin) present in Roseimaritima ulvae UC8. Furthermore, and due to scarce knowledge of antibiotic resistance in Planctomycetes and the need of identifying a selection marker for this protocol, the antibiotic susceptibility profile of several Planctomycetes was addressed. Through a modified Kirby-Bauer method, a broad screening of antibiotic susceptibility of six phylogenetically different Planctomycetes was performed. Results showed that antibiotics targeting the DNA replication or the protein synthesis (except for aminoglycosides) were the most effective against tested strains, with the highest efficacy being observed for chloramphenicol, clindamycin and ciprofloxacin. This screening allowed the identification of erythromycin as an adequate antibiotic to serve as selection marker, since it was the only antibiotic for which all the tested strains were susceptible. The previously described resistance against beta-lactam antibiotics, aminoglycosides and glycopeptides were observed in all strains. The yet uncharacterized Planctomyces sp. strain FF15 showed the highest level of antimicrobial resistance, being susceptible only to erythromycin and ciprofloxacin. Due to its unique antibiotic resistance profile and the fact that it is a novel undescribed species, its ultrastructure was studied. Common Planctomycetes characteristics were although observed. The obtained results in the antibiotic susceptibility screening were validated by the assays with Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 29213. Furthermore, and because Planctomycetes are cultivated in marine media, both control strains were also screened in marine media. The obtained results proved that salinity can increase or decrease the susceptibility to certain antibiotics in these strains. This effect was only been previously identified in E. coli for tetracycline and chloramphenicol. For the triparental mating study, specific primers were designed to create donor plasmids which were constructed and their functionality tested in E. coli. Although seven attempts to achieve triparental mating were performed, only once, in the fifth attempt, candidate colonies of R. ulvae UC8 were obtained. However, confirmation of mating could not be achieved. This work evidences the difficulty to genetically modify Planctomycetes and broadens our knowledge in the antibiotic resistance behaviour of this phylum.

O filo Planctomycetes inclui membros com características invulgares entre as bactérias como proteínas “membrane coat-like”, síntese de esterol e um novo mecanismo de absorção de macromoléculas não caracterizado. Estas características tornam os Planctomycetes relevantes no estudo de diferentes áreas do conhecimento. Para compreender as maquinarias subjacentes a estas características únicas, estudos moleculares surgiram recentemente. Analise in silico do genoma de Planctomycetes permitiram a identificação de vários genes gigantes com mais de 15 kb, mas cuja função dos seus produtos é ainda desconhecida. No presente estudo, um protocolo de conjugação triparental foi desenvolvido com a finalidade de avaliar a função de um destes genes gigantes (o UC8_04175 Matrixin) presente em Roseimaritima ulvae UC8. Uma vez que o conhecimento sobre a resistência a antibióticos nos Planctomycetes é escasso, e dada a necessidade de identificar um marcador de seleção para este protocolo, o perfil de suscetibilidade a antibióticos de diversos Planctomycetes foi estudado. Através do método de Kirby-Bauer modificado, foi realizado um vasto ensaio de suscetibilidade a antibióticos de seis espécies filogeneticamente diferentes. Os resultados mostraram que antibióticos que têm como alvo a replicação de DNA ou a síntese proteica (com excepção dos aminoglicosídeos) foram os mais eficazes as estirpes testadas, tendo elevada eficácia tendo sido observada com cloranfenicol, clindamicina e ciprofloxacina. Este ensaio permitiu identificar que a eritromicina era um antibiótico adequado como marcador de seleção, uma vez que foi o único antibiótico para o qual todas as estirpes testadas foram suscetíveis. A resistência previamente descrita contra beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e glicopéptidos foi observada em todas as estirpes. A estirpe ainda não caracterizada Planctomyces sp. estirpe FF15 mostrou o nível mais elevado de resistência antimicrobiana tendo sido apenas suscetível à eritromicina e ciprofloxacina. Devido ao seu perfil único de resistência e ao facto de esta ser uma nova espécie ainda não caracterizada, a sua ultraestrutura foi estudadas. Características comuns aos outros Planctomycetes foram, contudo, observadas. Os resultados obtidos no ensaio de suscetibilidade a antibióticos foram validados através de ensaios com Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213. Além disso, e uma vez que os Planctomycetes são cultivados em meios marinhos, ambas as estirpes controlo foram também analisadas em meios marinhos. Os resultados obtidos mostraram que a salinidade pode aumentar ou diminuir a suscetibilidade a certos antibióticos nestas estirpes. Este efeito apenas tinha sido previamente observado em E. coli para tetraciclina e cloranfenicol. Relativamente ao estudo da conjugação triparental, oligonucleótidos de iniciação específicos foram desenhados para construir plasmídeos dadores cuja construção e funcionalidade foi testada em E. coli. Apesar de terem sido efetuadas sete tentativas para conseguir obter a conjugação triparental, apenas uma vez, na quinta tentativa, foram obtidas colónias candidatas de R. ulvae UC8. Contudo, a confirmação de obtenção da conjugação não foi possível. Este trabalho evidência a dificuldade de modificar geneticamente os Planctomycetes e expande o nosso conhecimento sobre o conhecimento sobre o comportamento de resistência a antibióticos deste filo.