Estudo da heterogeneidade de tumores mamários: metabolómica de um modelo animal

Abstract

O cancro da mama (BCa) é a neoplasia mais diagnosticada e a principal causa de morte por cancro nas mulheres. Apesar dos avanços nas metodologias de rastreio, diagnóstico e tratamento, a heterogeneidade inter- e intra-tumoral do BCa está na base dos atuais desafios relativos ao tratamento da doença. Os tumores mamários induzidos por acetato de medroxiprogesterona (MPA) em murganhos têm grande potencial informativo já que apresentam o fenótipo mais comum do BCa humano. Apesar de já terem sido investigados em termos de resposta ao tratamento hormonal, ainda não foram explorados através de estudos metabolómicos. De forma a caracterizar melhor o metabolismo destes tumores, nesta tese analisou-se o metaboloma de extratos aquosos e lipídicos obtidos pelo método de metanol-clorofórmio-água. Cada um dos tumores foi seccionado em 8 frações (octantes), sendo 4 destas armazenadas para estu-dos futuros. Recorrendo à espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN, 500 MHz) de 1H, aliada a métodos de análise estatística univariada e multivariada, teve-se como objetivos principais determinar as maiores varia-ções metabólicas entre: a) tumores de diferentes tipos (tumores P, Q, R e S do tipo 59-2-HI vs. tumores T, U e V do tipo C7-2-HI); b) tumores do mesmo tipo; c) frações distintas de cada tumor individual. Considerando que, na com-paração entre os tipos de tumores, apenas o tumor P se diferenciou dos res-tantes do seu tipo, foram discutidas razões possíveis para que tal ocorresse e este tumor foi excluído de forma a que apenas se analisassem as diferenças intrínsecas entre os tumores 59-2-HI e C7-2-HI. Relativamente aos tumores C7-2-HI, os tumores 59-2-HI apresentaram níveis significativamente: a) mais elevados de vários ácidos orgânicos (piruvato, succinato, citrato e fumarato), compostos de colina (colina e glicerofosfocolina), bases azotadas (uracilo e hipoxantina), nucleósidos (adenosina/inosina), outros metabolitos conhecidos (creatina, esfingomielina, etanolamina, glicerol e glutamato) e compostos des-conhecidos; b) mais baixos de diversos aminoácidos essenciais (Ile, Leu, Val, Thr, Lys, Met e Phe) e não essenciais (Ala, Asn, Gln, Pro,Ser e Tyr), poliálcoois (myo- e scyllo-inositol) e outros metabolitos (fosfocolina, uridina e acetona), incluindo compostos desconhecidos. Entre os tumores 59-2-HI, o tumor P apresentou um perfil médio de metabolitos hidrofílicos que, segundo a litera-tura, possivelmente poderá refletir um fenótipo mais agressivo e invasivo (prin-cipalmente devido ao nível mais elevado de piruvato, lactato e formato e mais baixo de taurina). Comparativamente com os tumores Q, R e S do tipo 59-2-HI, os tumores C7-2-HI mostraram uma heterogeneidade inter-tumoral relati-vamente inferior. Quanto à heterogeneidade intra-tumoral, constatou-se que o tumor P era o mais variável em termos de metabolitos hidrofílicos, mas o me-nos variável em metabolitos lipofílicos. Em relação aos tumores Q, R e S do tipo 59-2-HI, os tumores C7-2-HI exibiram mais metabolitos com uma variabilidade intra-tumoral elevada (e.g. adenosina/inosina e fumarato). Diver-sos resultados desta tese foram ao encontro da maior agressividade do tipo C7-2-HI, não só por este apresentar algumas características metabólicas co-muns às descritas na literatura para tumores mais metastáticos (como o maior nível de aminoácidos, alguns intermediários do ciclo de Krebs e acetona, em relação ao tipo 59-2-HI), mas também por geralmente exibir maior heteroge-neidade inter- e intra-tumoral do que o tipo 59-2-HI (sem considerar o tumor P). Em suma, como era esperado, a heterogeneidade metabólica entre os ti-pos tumorais foi mais prevalente do que as diferenças observadas entre tumo-res do mesmo tipo e a um nível intra-tumoral, sendo que estas últimas também se verificaram e foram significativas. Considerando a heterogeneidade e o per-fil metabólico que apresentaram, os tumores analisados nesta tese pareceram também ser razoavelmente representativos do BCa humano

Breast cancer (BCa) is the most frequent cancer and the leading cause of cancer death among women. Despite all advances in screening, diagnosis and treatment methodologies, the inter- and intra-tumour heterogeneity in breast cancer is still clinically challenging. The relevance of medroxyprogesterone acetate (MPA)-in-duced murine mammary tumours in BCa research lies in the fact that they exhibit the most common phenotype of the human disease. Although the response of this model to hormonal therapy has already been investigated, it has not yet been ex-plored through metabolomics. In this thesis, the metabolome of aqueous and lipid extracts obtained by the methanol-chloroform-water method were analysed to bet-ter characterize the metabolism of these tumours. Each of the tumours was sec-tioned into 8 fractions (octants), 4 of which were stored for future studies. Using 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR, 500 MHz), together with univari-ate and multivariate statistical analysis, we aimed to determine the main metabolic variations between: a) tumours of different types (tumours P, Q, R and S of the type 59-2-HI vs. tumours T, U and V of the type C7-2-HI); b) tumours of the same type; c) different fractions of each individual tumour. Considering that, in the comparison between tumour types, tumour P was the only one that differed from the others of its type, the possible reasons for such result were discussed and this tumour was excluded in further analysis of intrinsic differences between tumour types. With re-spect to C7-2-HI tumours, 59-2-HI tumours showed significantly: a) higher levels of some organic acids (pyruvate, succinate, citrate and fumarate), choline containing compounds (choline and glycerophosphocholine), nitrogenous bases (uracil and hypoxanthine), nucleosides (adenosine / inosine), other known metabolites (crea-tine, sphingomyelin, ethanolamine, glycerol and glutamate) and unknown com-pounds; b) lower levels of several essential (Ile, Leu, Val, Thr, Lys, Met and Phe) and nonessential amino acids (Ala, Asn, Gln, Pro, Ser and Tyr), polyalcohols (myo- and scyllo-inositol), other metabolites (phosphocholine, uridine and acetone) in-cluding unknown compounds. Among 59-2-HI tumours, tumour P showed a polar metabolome that, according to the literature, may reflect a more aggressive and invasive phenotype (mainly due to the higher level of pyruvate, lactate and format and lower level of taurine). In comparison to C7-2-HI tumours, 59-2-HI tumours (Q, R, and S) were shown to have a relatively lower inter-tumour heterogeneity. Re-garding intra-tumour heterogeneity, tumour P was the most variable in terms of hydrophilic metabolites, but the least variable in terms of lipophilic metabolites. When compared to 59-2-HI tumours Q, R and S, C7-2-HI tumours revealed more metabolites with high intra-tumour variability (e.g. adenosine/inosine and fumarate). Several results of this thesis were in agreement with the higher aggres-siveness of the type C7-2-HI, not only because it presents some metabolic char-acteristics common to those described in literature for more metastatic tumours (such as higher levels of amino acids, some Krebs cycle intermediates and ace-tone, compared to 59-2-HI tumours), but also because it exhibits a generally greater inter- and intra-tumour heterogeneity than the 59-2-HI type (excluding tu-mour P). In summary, as expected, metabolic heterogeneity between tumour types was larger than the differences observed within tumours of the same type and at the intra-tumoral level, although the latter were also measurable and significant. The tumours analysed in this thesis showed a metabolic heterogeneity and profile con-sidered reasonably representative of the human BCa