Utilização de Danio rerio como modelo para a estimativa do intervalo post morten com base no estado de metilação

Abstract

O intervalo post mortem (IPM) descreve o período de tempo decorrido desde a morte até ao exame do cadáver. Uma estimativa precisa do IPM tem um grande impacto numa investigação criminal, no entanto, é uma tarefa bastante complexa, dada a influência de fatores intrínsecos e extrínsecos. Existem diversos métodos para a determinação de parâmetro, sendo eles baseados na anatomia patológica, bioquímica e entomologia. Uma vez que estas metodologias possuem baixa precisão e inúmeras limitações práticas, surgem os métodos genético-moleculares, baseados no estado de degradação dos ácidos nucleicos. A metilação do ADN é uma modificação epigenética estável e que varia ao longo do tempo, tornando-se útil para o desenvolvimento de um método de determinação do IPM. Foram analisados os níveis de metilação de um organismo modelo – peixe-zebra – ao longo do tempo decorrido desde a morte, no sentido de criar um modelo robusto para a estimativa do IPM. Neste estudo avaliou-se a variação ocorrida nos níveis de metilação global e na região promotora do gene EDARADD durante 6 intervalos post mortem (0h, 1h, 4h, 24h, 48h e 72h). Diversos parâmetros foram otimizados entre os quais a amostragem, extração e amplificação de ADN genómico de peixe-zebra. Na análise da metilação global, observou-se um aumento dos níveis nos intervalos post mortem iniciais, seguido de uma diminuição abrupta até às 48h post mortem. Foi possível diferenciar as amostras consoante o IPM a que pertenciam através da amplificação por q-PCR da região promotora do gene EDARADD seguida de análise HRM.

The post mortem interval (PMI) describes the period of time elapsed from the time of death. A precise estimation of PMI has a strong impact in a crime investigation; however it is a complex task due to the influence of intrinsic and extrinsic factors. There are several methods for PMI determination including pathological, biochemical and entomological. Those methodologies have low precision and several practical limitations leading to emergence of genetic-molecular methods based on the degradation of nucleic acids. DNA methylation is a stable and time-varying epigenetic modification, making it useful for the development of a method to determining PMI. Thus, the methylation levels of a model organism – zebrafish – were analysed during the time since death, in order to create a robust model for the PMI estimation. In this study, we evaluated the variation in global methylation levels and at the promoter region of EDARADD gene during 6 post mortem intervals (0h, 1h, 4h, 24h, 48h e 72h). We performed an optimization of several parameters such us sampling, extraction and amplification of zebrafish genomic DNA. An increase of global methylation levels in the initial post-mortem intervals was observed, followed by an abrupt decrease until 48h post-mortem. Following of the amplification of EDARADD’s promoter region by q-PCR and HRM analysis, it was possible to differentiate the samples according to relative PMI.