Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/25405
Title: Testing the cis-regulatory of type 2 diabets associated non-coding sequences
Other Titles: O potencial regulatório em cis de sequências não codificantes associadas a diabetes tipo 2
Author: Eufrásio, Ana Catarina Macedo
Advisor: Miranda, Luís Souto de
Bessa, José
Keywords: Type 2 diabetes
Endocrine islet
β-cells
Genome wide association studies
Single nucleotide polymorphism
Enhancer
Transcription factor
Defense Date: 20-Dec-2018
Abstract: Type 2 diabetes (T2D) affects over 300 million people, causing severe complications and premature death, yet the underlying molecular mechanisms are largely unknown. This condition is partially characterized by endocrine pancreatic islet dysfunction, leading to insufficient insulin production. By now, genome-wide association studies have shown that some single nucleotide polymorphisms (SNPs) are associated to T2D. Part of these variants are located in non-coding sequences with marks for enhancer activity, and some of them overlap with binding sites of transcription factors (TFs) known to be required for proper endocrine pancreas function. Enhancers are non-coding sequences that regulate the expression of their target genes by interacting with their promoters in cis. Our working hypothesis is that T2D associated SNPs might impair TF binding, affecting the enhancer activity of the sequence, ultimately translating into transcriptional changes of the downstream genes. At first, to approach this hypothesis, we have performed in vivo transgenesis assays in zebrafish to test if sequences overlapping with T2D associated loci were enhancers. We found that five out of ten tested sequences are endocrine pancreas enhancers. Secondly, we analyzed the impact of the risk associated variant in the enhancer activity. We found that in one out of three sequences, the enhancer activity was disrupted by the presence of a single nucleotide modification in a putative binding site for PDX1, an important transcription factor in pancreas development. We further analyzed this sequence by dividing it in fragments, testing them for endocrine enhancer activity. These results lead us to conclude that most likely the loss of the PDX1 binding site is accompanied by the gain of a repressor binding site that might contribute to the inactivation of the tested enhancer. As future approaches, we will test the enhancer activity of the selected sequences in human beta cell lines and perform Circularized Chromosome Conformation Capture (4C-seq) to identify the enhancer’s target genes. Overall this project will help to better understand the importance of non-coding variants in the development of T2D.
A diabetes tipo 2 (DT2) afeta mais de 300 milhões de pessoas em todo o mundo, causando complicações severas e morte prematura. Contudo, os mecanismos moleculares associados a esta doença são, atualmente, pouco conhecidos. DT2 é caracterizada, em parte, pela disfunção de ilhotas endócrinas pancreáticas, não havendo produção suficiente de insulina. Os recentes avanços em estudos de associação em larga escala genómica têm demonstrado uma clara associação entre polimorfismos de um só nucleótido (PSN) e D2T. Uma grande parte destas variantes estão localizadas em sequências não codificantes que coincidem com marcas epigenéticas de potenciadores e de sítios de ligação de fatores de transcrição essenciais para uma boa função e organização das ilhotas endócrinas. Os potenciadores são sequências não-codificantes que regulam a expressão dos seus genes-alvo, interagindo com os promotores em cis. A hipótese do presente projeto científico é demonstrar que os PSNs associados a D2T podem afetar os sítios de ligação dos fatores de transcrição e consequentemente, a atividade das sequências regulatórias potenciadoras, traduzindo-se em diferenças transcricionais do gene. A primeira abordagem para testar a hipótese centralizouse em ensaios de transgénese em peixe-zebra. Cinco das dez sequências testadas foram consideradas potenciadoras em pâncreas endócrino. A segunda abordagem baseou-se no impacto das variantes nas sequências potenciadoras. Numa sequência, a atividade potenciadora foi afetada pela presença de uma variante num sítio de ligação de PDX1, um fator de transcrição importante no desenvolvimento do pâncreas. Como perspetivas futuras, irão ser testadas as sequências em células β humanas em cultura e identificar-se-ão os genes-alvo das sequências, por 4C, captura de conformação cromossómica circularizada. Este trabalho ajudará a compreender melhor a importância da presença de variantes em genoma não-codificante no desenvolvimento de DT2.
URI: http://hdl.handle.net/10773/25405
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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