Role of metals in the selection of antibiotic resistance

Abstract

The environment is increasingly recognized for its role in the global dissemination of antibiotic resistance - one of the biggest threats to global health. Several non-antibiotic contaminants seem to increase this problem. This study aimed to investigate the role of metals in the selection of antibiotic resistance. To achieve this goal, two strategies were used: 1) an experimental evolution approach and 2) a microcosm-based assay with complex bacterial communities. For this, Escherichia coli ATCC® 25922™ and Aeromonas hydrophila CECT 839T populations were evolved in increasing concentrations of copper and zinc for 80 days and phenotypic and genotypic changes were investigated. Alterations in the tolerance of the evolved populations to other metals was assessed. Antibiotic susceptibility testing by disc diffusion and antibiotic MIC determination were performed. Growth assays were performed to evaluate the effect of metal exposure in bacterial fitness. Genotypic alterations were assessed by rep-PCR. Evolution in the presence of copper or zinc led to an increased tolerance against other metals such as chromium or nickel. Also, E. coli populations evolved with copper increased their MICs for kanamycin, imipenem and sulfamethoxazole; whereas MICs of populations evolved with zinc followed this trend for sulfamethoxazole. Concerning A. hydrophila, populations evolved with copper and zinc increased their MICs for kanamycin. In a few cases, results from disc diffusion tests were inconsistent with MICs determination. Growth assays revealed a fitness cost for E. coli populations evolved with metal, which was not verified for evolved A. hydrophila populations. Severe genotypic alterations were not detected. For the microcosm-based experiment, lab scale microcosms were steed up to confirm selection of antibiotic resistance in aquatic bacterial communities imposed by exposure to copper and zinc for 20 days. Water samples were collected from Antuã river. After metal exposure, colony-forming units were counted in culture media with and without antibiotics. From microcosms exposed to copper and zinc, cefotaxime and kanamycin resistant bacteria were selected and identified. DGGE analyses were performed to assess metal effects in exposed bacterial communities’ structure. Results showed a significant increase in the prevalence of bacteria resistant to cefotaxime and tetracycline in communities exposed to copper; whereas in communities exposed to zinc an increase in bacteria resistant to cefotaxime and kanamycin was verified. Cefotaxime and kanamycin resistant bacteria belonged to genera intrinsically resistant to these compounds, i.e. Pseudomonas spp. and Sphingomonas spp. DGGE profiling revealed that metal exposure altered the structure of bacterial communities while decreasing richness and diversity. This study confirmed that metal exposure induces significant changes in bacterial strains, leading to higher metal and antibiotic tolerance. In aquatic system bacterial communities, metal exposure leads to a higher prevalence of antibiotic-resistant strains.

O ambiente tem vindo a ser reconhecido pelo seu papel na disseminação de resistência a antibióticos – uma das maiores ameaças para a saúde mundial. Para além dos antibióticos, vários outros contaminantes ambientais parecem contribuir para este problema. Este estudo teve como objetivo investigar o papel dos metais na seleção de resistência a antibióticos. Para tal, duas estratégias foram utilizadas: 1) uma abordagem de evolução experimental e 2) um ensaio baseado em microcosmos com comunidades bacterianas complexas. Para tal, populações de Escherichia coli ATCC® 25922™ e Aeromonas hydrophila CECT 839T foram expostas a concentrações crescentes de cobre e zinco durante 80 dias para investigar alterações genotípicas e fenotípicas. Alterações na tolerância destas populações a outros metais foram avaliadas, assim como a sua suscetibilidade a antibióticos pelo método de difusão em disco. A determinação de concentrações mínimas inibitórias (CMIs) de alguns antibióticos foi também realizada. Ensaios de crescimento foram realizados, para avaliar o efeito desta exposição no fitness bacteriano. Alterações genotípicas foram avaliadas por repPCR. A exposição a cobre e zinco levou ao aumento da tolerância destas populações a outros metais como crómio e níquel. Populações de E. coli evoluídas na presença de cobre aumentaram a sua tolerância à canamicina, imipenemo e sulfametoxazol; enquanto que populações de E. coli expostas a zinco aumentaram a tolerância ao sulfametoxazol. Populações de A. hydrophila evoluídas na presença destes metais aumentaram a tolerância à canamicina. Os resultados da determinação de CMIs nem sempre estiveram de acordo com os resultados do teste da suscetibilidade a antibióticos por difusão em disco. Ensaios de crescimento revelaram um custo de adaptação para populações de E. coli evoluídas com metal, o que não foi verificado para populações de A. hydrophila. Alterações genotípicas severas não foram detetadas. Microcosmos foram implementados para confirmar a seleção de resistência a antibióticos em comunidades bacterianas aquáticas, imposta pela exposição a cobre ou zinco por 20 dias. Para tal, foram recolhidas amostras de água do rio Antuã. Depois da exposição ao metal, foi determinada a abundância bacteriana e a prevalência de resistência a vários antibióticos. Bactérias resistentes à cefotaxima e à canamicina, que tinham sido expostas a estes metais, foram identificadas. Análises de DGGE foram realizadas para avaliar os efeitos do metal na estrutura das comunidades bacterianas expostas. Os resultados mostraram um aumento da prevalência de bactérias resistentes a cefotaxima e tetraciclina, em comunidades expostas a cobre; enquanto que em comunidades expostas ao zinco se verificou um aumento significativo da prevalência de bactérias resistentes a cefotaxima e canamicina. Bactérias resistentes à cefotaxima e canamicina pertenciam a géneros intrinsecamente resistentes a estes compostos, por exemplo, Pseudomonas e Sphingomonas. O perfil de DGGE destas comunidades revelou que a exposição ao metal altera a sua estrutura diminuindo a sua riqueza e diversidade. Este estudo confirmou que a exposição a metais induz alterações significativas nas estirpes bacterianas, levando a fenótipos de maior tolerância a metais e antibióticos. Em comunidades bacterianas do sistema aquático, a exposição a metais leva a uma maior prevalência de estirpes resistentes a antibióticos. keywords Antibiotic resistance, metals, copper, zinc, co-selection, aquatic systems, microcosms, experimental evolution assay, bacterial communities.