Metabolomics study of flavonoid-induced metabolic reprogramming in human macrophages

Abstract

The ability of macrophages to change between pro-inflammatory (M1-like) and anti-inflammatory (M2-like) phenotypes makes their modulation an attractive therapeutic strategy to mitigate excessive and/or chronic inflammation. Bioflavonoids are natural compounds with well documented anti-inflammatory activity. However, little is known about their molecular and metabolic effects on human macrophages. In this thesis, NMR metabolomics has been used to assess how different bioflavonoids (Quercetin, Naringenin and Naringin) modulate the metabolism of human macrophages, with a view to better understand their modes of action. In vitro-cultured macrophages differentiated from human THP-1 monocytes were treated with each flavonoid, both in the uncommitted state (M0) or after pre-polarization with LPS/IFN-γ (M1). Treatment with IL-4/IL-13 (M2) was also carried out for comparison. Cells were solvent-extracted to obtain the polar fractions and subsequently analysed by 1H NMR spectroscopy. Near 50 intracellular metabolites were detected (endometabolome), whereas analysis of cells-conditioned culture medium (exometabolome) was useful to assess consumption and excretion patterns. Multivariate analysis and discrete quantitative assessments of metabolic profiles revealed consistent variations upon macrophage exposure to the different stimuli. The three flavonoids produced pronounced metabolic alterations, with the strongest impact being observed for Quercetin and the mildest for Naringin. The main effects shared by all flavonoids, especially in M1 pre-polarized macrophages, comprised downregulation of glucose uptake and decreased energetic pools (ATP, UTP, phosphocreatine). Other effects were highly flavonoid-specific, namely TCA cycle modulation and amino acid metabolism, antioxidant response and variations in membrane-related metabolites. Overall, this work has shown that, although sharing similar ability to attenuate pro-inflammatory activity of macrophages, the three flavonoids affect macrophage metabolism in distinct ways. Future studies should entail assessment of key metabolic enzymes to further advance current understanding on flavonoid-mediated modulation of macrophage metabolism. This knowledge is expected to support the development of flavonoids as immunomodulatory drugs, especially aimed at attenuating and/or resolving inflammation, for instance, in the context of chronic inflammatory diseases or the rejection of biomaterial implants.

A capacidade dos macrófagos alterarem o seu fenótipo entre estados pro-inflamatórios (tipo-M1) e anti-inflamatórios (tipo-M2), faz com que a sua modulação seja uma estratégia promissora para mitigar a inflamação excessiva e/ou crónica. Os bioflavonóides são compostos naturais com atividade anti-inflamatória bem documentada. No entanto, pouco se sabe acerca dos seus efeitos metabólicos em macrófagos humanos. Nesta tese, utilizou-se a metabolómica baseada em RMN para averiguar de que forma diferentes bioflavonóides (Quercetina, Naringenina e Naringina) modulam o metabolismo de macrófagos humanos, com vista a compreender melhor os seus mecanismos de ação. Macrófagos derivados de monócitos humanos THP-1 foram cultivados in vitro e tratados com cada flavonóide, tanto no estado não-polarizado (M0) como após uma pré-polarização com LPS/IFN-γ (M1). A estimulação com IL-4/IL-13 (M2) foi também empregue para comparação. As frações polares das células foram obtidas por extração com solventes orgânicos e subsequentemente analisadas por espetroscopia de RMN-1H. Perto de 50 metabolitos intracelulares foram identificados (endometaboloma), sendo que a análise dos meios de cultura (exometaboloma) foi útil para estudar padrões de consumo e excreção. O estudo dos perfis metabólicos através de análise multivariada e quantitativa revelou variações consistentes perante os diferentes estímulos fornecidos aos macrófagos. Os três flavonóides causaram diferentes alterações metabólicas, sendo que o maior impacto foi observado para a Quercetina e o menor para a Naringina. Os principais efeitos partilhados por todos os flavonóides, especialmente em macrófagos pré-polarizados para M1, incluíram diminuição do consumo de glucose e das reservas energéticas (ATP, UTP, fosfocreatina). Outros efeitos foram muito específicos dependendo do flavonóide, nomeadamente a modulação do ciclo TCA e do metabolismo de aminoácidos, a resposta anti-oxidante e variações em metabolitos associados às membranas. De forma geral, este estudo demonstrou que, apesar de apresentarem capacidade semelhante de atenuar a atividade pró-inflamatória de macrófagos, os três flavonóides afetaram o metabolismo celular de formas distintas. Em estudos futuros, será importante avaliar a expressão/atividade de enzimas metabólicas chave, de modo a incrementar o conhecimento atual sobre a modulação do metabolismo de macrófagos mediada por flavonóides. Este conhecimento deverá pois suportar o desenvolvimento de flavonóides como fármacos imunomodulatórios, especialmente direcionados para a atenuação e/ou resolução da inflamação, por exemplo, no contexto de doenças associadas a inflamação crónica ou da rejeição de biomateriais implantados.