DNA metabarcoding approach as a complementary technique for assessment of Portuguese rivers using diatoms

Abstract

The Water Framework Directive (WFD) is the main political instrument for management of the waterbodies in Europe and includes the bioassessment of rivers and streams based on diatoms, through the calculation of an autoecological index, the Indice de Polluosensibilité Spécifique (IPS) officially adopted for Portugal. This index requires a high level of taxonomic expertise for morphological identification of individuals. Advances in genomics, such as the DNA metabarcoding combined with high-throughput sequencing (HTS) techniques offer a promising alternative to classical methods, limiting expertise requirement and therefore reducing time and costs. The aim of this study was to test the potential of DNA metabarcoding of diatoms in the bioassessment of Portuguese rivers by comparing the IPS classifications obtained with morphological and molecular approaches. A total of 88 samples from rivers in central Portugal were collected in the spring of 2017 following WFD standards. The morphological approach comprised taxonomic identification of at least 400 valves, under the light microscope. The molecular approach included eDNA extraction followed by DNA sequencing (Illumina MiSeq) using a 312bp rbcL DNA barcode. Sequences were analysed with Mothur software, producing Operational Taxonomic Units (OTUs) that were taxonomically assigned to the R-Syst::diatom reference library. It was also tested the effect of a correction factor (CF) for biovolume applied on molecular data. Inventories of diatom communities revealed a total number of 306, 125 and 111 species identified with morphology, molecular method without and with the CF, respectively. The total percentage of successfully assigned OTUs to the reference library was 32%, with an average of 47.5% per sample, while the average percentage of unassigned reads from the converted OTUs to taxa list was 52.5% and varied between 2 and 95%, among all samples. When comparing species’ abundances, the results showed statistical differences in the number of species between molecular and morphological inventories although the application of the CF approximated both approaches. The source of these differences may lay on the incompleteness of reference libraries, which currently represents the major difficulty in taxonomic assignment of eDNA sequencings. Regarding IPS values, the results indicated a good correlation between morphological and molecular methods, especially when applying the CF. NMDS and PCO diagrams based on species abundances revealed a gradient of quality classifications in all 3 methodologies. These support the hypothesis that DNA metabarcoding may be a valid approach for ecological quality assessment. Yet, there is still work to be done on this new methodology in order to be able to make a smooth transition between the traditional and this new approach without misspend accumulated knowledge from the last decades on water quality assessment

A Directiva Quadro de Água (DQA) é o principal instrumento político de gestão das massas de água na Europa e inclui a avaliação biológica de rios e riachos através das diatomáceas, mediante o cálculo de um índice autoecológico, o Indice de Polluosensibilité Spécifique (IPS), adotado oficialmente para Portugal. Este índice requer um alto nível de conhecimento taxonómico para a identificação morfológica dos indivíduos. Avanços na área da genómica, como o metabarcoding de DNA combinado com técnicas de sequenciamento de alto rendimento (HTS), oferecem uma alternativa promissora aos métodos clássicos, limitando a exigência de especialização e, portanto, reduzindo o tempo e os custos. O objetivo deste estudo foi testar o potencial do metabarcoding de DNA de diatomáceas na avaliação biológica de rios portugueses, comparando as classificações do IPS, obtidas com abordagens morfológica e moleculares. No total, 88 amostras de rios do centro de Portugal foram recolhidas na primavera de 2017, seguindo as normas da DQA. A abordagem morfológica incluiu a identificação taxonómica de pelo menos 400 valvas ao microscópio ótico. A abordagem molecular compreendeu a extração de eDNA seguida de sequenciação (Illumina MiSeq) usando o barcode de DNA rbcL com 312pb. As sequências foram analisadas com o software Mothur, produzindo Unidades Taxonómicas Operacionais (UTOs) atribuídas à biblioteca de referência R-Syst::diatom. Testou-se também o efeito de um fator de correção (FC) para o biovolume aplicado aos dados moleculares. Os inventários das comunidades de diatomáceas revelaram um total de 306, 125 e 111 espécies identificadas através da morfologia e método molecular sem e com FC, respetivamente. A percentagem total de UTOs atribuídos com sucesso à biblioteca de referência foi de 32%, com uma média de 47,5% por amostra, enquanto a percentagem média de leituras “não classificadas” dos UTOs convertidos em lista de taxa foi de 52,5% e variou entre 2 e 95%, entre todas as amostras. Ao comparar as abundâncias das espécies, os resultados mostraram diferenças estatísticas em relação ao número de espécies dos inventários moleculares e morfológico, embora a aplicação do FC tenha aproximado as duas abordagens. A fonte dessas diferenças pode estar na necessidade de completar as bibliotecas de referência, representando, atualmente, a maior dificuldade na atribuição taxonómica das sequências de eDNA. Em relação aos valores de IPS, os resultados indicaram uma boa correlação entre os métodos morfológico e moleculares, especialmente quando se aplicou o FC. Os diagramas de NMDS e PCO baseados na abundância das espécies revelaram um gradiente de classificações de qualidade em todas as 3 metodologias, apoiando a hipótese de que o metabarcoding de DNA pode vir a ser abordagem válida para avaliação da qualidade ecológica. No entanto, ainda há trabalho a ser feito nesta área no sentido de proporcionar uma transição suave entre a abordagem tradicional e a mais recente, sem perder de vista o conhecimento acumulado nas últimas décadas sobre a avaliação da qualidade da água