Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/25078
Title: CDC42 role in APP-mediated cell migration
Other Titles: O papel da CDC42 na migração celular mediada por APP
Author: Pascoal, Flavia Sofia Rodrigues de Almeida
Advisor: Vieira, Sandra Isabel Moreira Pinto
Keywords: APP
Cdc42
Cell Migration
Direction of migration
Migratory Phenotype
F-actin
Defense Date: 14-Dec-2018
Abstract: Cellular migration is transversal to several cellular processes such as embryogenesis, metastasis, immune response and regeneration. The amyloid precursor protein and the Cdc42 protein have been separately associated with several processes related to cell migration, namely: velocity, cell adhesion, cell polarization, and the development of migratory structures such as filopodia and lamellipodia. In this work we intended to confirm the role of APP in persistent direction of migration of neuronal-like cells, previously observed in our group, and to investigate if APP interacted with Cdc42 in this same process. Cell biology studies were carried out on SH-SY5Y cells transfected with APP-GFP and DsRed-Cdc42 (wt ou dominant negative, DN) cDNAs, and a Scratch Wound Healing assay was used to study cell migration parameters. Cells migration was monitored hourly for 13 hours by microscopy means, and the path, distance and velocity of the cells were analyzed with the help of the Image J software. We also analyzed the effects of these two proteins on the cell morphology using immunocytochemistry assays. Finally, we intended to study the influence of APP on the dynamics of F-actin in neuronal-like cells, to compare with our previous results in non-neuronal cells. For this we resorted to a FRAP analysis of live cells co-expressing APP-GFP and LifeAct-RFP, a fluorescent marker of F-actin. The results confirmed that APP positively influences persistence in the migration direction of SH-SY5Y cells. However, when co-expressed with Cdc42 wt the cells no longer migrated in a targeted manner. When Cdc42 was overexpressed but its catalytic activity inhibited (Cdc42 DN), the migration returned to a more directed pattern, which leads us to believe that APP does not increase persistence in the migration direction via Cdc42 activation. On the other hand, the presence of APP decreases both parameters of total migrated distance and the cells’ migration velocity in relation to the control GFP, and the presence of Cdc2 wt further decreased these values. In this case, inhibition of Cdc42 activity annulled APP effect, and cells returned to distance and velocity values similar to control cells. Regarding the acquisition of migratory phenotype, APP showed litle influence, unlike both Cdc42 (Wt and DN) that increased the percentage of cells with this phenotype, proving that the Cdc42 molecule alone is important for the cells polarization. Finally, we observed that APP tended to promote the dynamics of F-actin. These results contributed to better understand the mechanisms underlying the role of APP and Cdc42, and their functional interaction, in migration processes of neuronal-like cells.
A migração celular é transversal a vários processos celulares como embriogénese, metástase, resposta imunitária e regeneração. A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP) e a proteína GTPAse Cdc42 têm sido, separadamente, associadas a vários processos relacionados com migração celular, nomeadamente: velocidade, a polarização das células, e o desenvolvimento de estruturas migratórias como filopódias e lamelopódias. Neste trabalho pretendíamos confirmar o papel da APP na persistência na direção de migração de células de tipo neuronal, previamente observado pelo nosso grupo, e averiguar se a APP interagia com a Cdc42 neste mesmo processo. Para tal realizaram-se estudos de biologia celular em células SH-SY5Y transfetadas com cDNAs de APP-GFP e DsRed-Cdc42 (wt ou dominant negative, DN) e recorreu-se à técnica de “Scratch Wound Healing” que permite estudar vários parâmetros migratórios. A migração das células foi monitorizada hora a hora durante 13 horas por microscopia de fluorescência e o percurso, a distância e a velocidade de migração analisados com a ajuda do software Image J. Através de ensaios de imunocitoquímica analisámos o efeito destas duas proteínas na morfologia das células. Por último, estudámos a influência da APP na dinâmica da F-actina em células SH-SY5Y, comparando com dados prévios do nosso grupo para células não neuronais. Para tal recorreu-se à técnica de FRAP para análise “in vivo” de células que co-expressavam GFP ou APP-GFP, e um marcador fluorescente de F-actina (LifeAct-RFP). Os resultados obtidos confirmaram que a APP aumenta a persistência na direção de migração em células SH-SY5Y, mas que este aumento deixa de ocorrer quando se sobre-expressa a APP conjuntamente com Cdc42 wt. No entanto, quando há sobre-expressão de APP com Cdc42 DN, a migração volta a um padrão mais direcionado, o que leva a crer que a APP não aumenta o direcionamento das células via ativação da Cdc42. Por outro lado, a presença de APP diminui ambos os parâmetros distância total e a velocidade de migração das células, em relação ao controlo GFP, e a presença de Cdc2 wt potenciou esse efeito. Neste caso, a inibição da atividade da Cdc42 anulou o efeito da APP, sendo que as células voltaram a exibir valores de distância e velocidade semelhantes às células controlo. No que toca à aquisição de fenótipo migratório, a APP não teve grande influência neste, ao contrário de ambas as Cdc42 (wt e DN), que aumentaram a percentagem de células com fenótipo migratório, confirmando que a molécula da Cdc42 por si só é importante para a polarização das células. Por último, observámos que a APP parece favorecer a dinâmica da F-actina. Estes resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao papel da APP e da Cdc42, e sua interacção funcional, em processos de migração de células do tipo neuronal.
URI: http://hdl.handle.net/10773/25078
Appears in Collections:DCM - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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