Study of NAD metabolism in protein aggregation

Abstract

NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) is a pyridine involved in numerous biological processes, namely nutrient catabolism sustaining cellular energy metabolism. During aging, NAD levels decrease and a global proteostasis deregulation is observed. As many age-related diseases are neurodegenerative and characterized by the accumulation of protein aggregates, we hypothesized that NAD could prevent or ameliorate protein aggregation. To study the role of NAD metabolism in proteostasis, we used SH-SY5Y cells exposed to chemicals that modulate the levels of protein aggregation and NAD metabolism. Cells were stained with the ProteoStat® kit to detect protein aggregates and analysed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cell viability was measured with propidium iodide by flow cytometry and metabolic state was measured using the colorimetric resazurin assay. SH-SY5Y cells showed increased protein aggregation levels in the presence of the proteasome inhibitor MG132 over time. MG132 induced more aggregation than treatment of cells with a NAD metabolism inhibitor, although supplementation with NAD appeared to decrease protein aggregates. Fluorescence microscopy analysis corroborated the flow cytometry result. In all tested conditions cell viability was not altered, in contrast with metabolic state that was altered by chemical treatments. Supplementation with NAD appeared to decrease protein aggregates, and further studies are warranted to elucidate the role in proteostasis of the different NAD precursors and associated pathways.

NAD (Nicotinamida Adenina Dinucleótido) é uma piridina envolvida em vários processos biológicos, nomeadamente, catabolismo de nutrientes que sustentam a produção de energia na célula. Durante o envelhecimento, os níveis de NAD diminuem e uma desregulação global da proteostase é observada. Como muitas doenças ligadas ao envelhecimento são neurodegenerativas, onde ocorre acumulação de agregados de proteínas, colocamos a hipótese que o NAD poderá prevenir ou melhorar a agregação proteica. Para estudar o papel do metabolismo do NAD na proteostase, expusemos células SH-SY5Y a químicos que modelam os níveis de agregação proteica e de NAD. As células foram marcadas com o kit ProteoStat® para detetar os agregados proteicos e analisadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. A viabilidade celular foi medida com iodeto de propídio por citometria de fluxo e o estado metabólico foi medido usando o ensaio colorimétrico da resazurina. Células SH-SY5Y apresentaram um aumento de agregados proteicos na presença do inibidor de proteossoma MG132 ao longo do tempo. MG132 induziu mais agregação do que o tratamento com um inibidor do metabolismo de NAD, no entanto a suplementação com NAD pareceu diminuir esses agregados. A microscopia confocal corroborou os resultados de citometria de fluxo. Em todas as condições testadas, a viabilidade celular não foi alterada, em contraste com o estado metabólico que foi alterado pelos tratamentos. Suplementação com NAD pareceu diminuir a agregação proteica e estudos futuros serão necessários para elucidar o papel na proteostase dos diferentes precursores de NAD e vias metabólicas associadas.