Ecotoxicological assessment of psychiatric drugs using freshwater planarians

Abstract

Psychiatric pharmaceutical substances are emergent chemical contaminants of the freshwater environment. They are bioactive with many different modes of action and side effects, and are meant to elicit beneficial effects at low concentrations but eliciting toxicity at higher concentrations. One of the major challenges to risk assessment of psychiatric substances in freshwaters is the choice of test organisms. The main objective of the present study was to investigate if the freshwater planarian Schmidtea mediterranea could be used as test organisms for the assessment of ecotoxicological effects of psychiatric pharmaceuticals namely fluoxetine and carbamazepine. Freshwater planarians are used as model in neuro-pharmacology and their nervous system resemble those of vertebrates, especially humans. S. mediterranea is among the best characterised animal models for regeneration and developmental biology studies. Moreover, this species is amenable to laboratory culturing and ecotoxicological testing. The study involved exposure of freshwater planarians to varying low concentrations of each of the psychiatric substances with a focus on organismal and population level endpoints. Moreover, since these compounds may occur together or concomitantly with other stressors within freshwaters, their effects when in mixtures were also evaluated. First the suitability of different S mediterranea responses as ecotoxicological endpoints were validated using laboratory assays and effects of tributyltin (TBT) exposure on locomotion, head regeneration and DNA damage (genotoxicity). Moreover, a feeding bioassay was developed as an additional sensitive behavioural endpoint. All parameters showed sensitivity to the tested concentrations with S. mediterranea showing to be one of the most sensitive invertebrates to TBT exposure. Concerning the effects of psychiatry drugs, laboratory assays showed that fluoxetine was more toxic than carbamazepine to S. mediterranea. Exposure to low concentrations of fluoxetine elicited decreases in feeding rates and reproduction (fissioning) and also an increase in locomotor activity and DNA damage. On the other hand, and despite some increases in locomotion observed in intermediate concentrations, no clear effects were observed for carbamazepine exposures. These responses show S. mediterranea as a putative good model organism to evaluate the ecological effects of psychiatric drugs in freshwaters and the relevance of these endpoints for these assessments. Laboratory assays testing for effects of the concomitant exposure to the two drugs revealed no interactions on planarian behavioural endpoints and reproduction, reinforcing at the same time the higher toxicity of fluoxetine. Concerning combined exposures of fluoxetine together with TBT here used as a model neurotoxic contaminant, results revealed complex interactions on DNA damage and locomotion, suggesting that effects of fluoxetine can be mediated by the simultaneous exposure to TBT. However, strong effects of both TBT and fluoxetine in all parameters call for additional research directed at the effects of this mixture using even lower concentrations. Lastly, effects of natural stressors like salinity on fluoxetine toxicity were investigated. Salinity level in freshwater environments recently has increased due to climate change and human activities and our results show that salinity levels as low as 0.75 – 3.0 g NaCl L-1 can adversely affect planarians causing decreases in locomotion, feeding and reproduction and also delaying head regeneration with some developmental abnormalities. Combined exposure showed significant interaction on planarian locomotor activity since both stressors elicited contrasting responses and no significant interactions were observed for reproduction. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that freshwater planarians can and should be used as alternative nonmodel invertebrates, for the risk assessment of psychiatric pharmaceuticals in freshwater environments and that behavioural, genotoxicity and reproduction endpoints should be included in this evaluation

Os fármacos psiquiátricos são atualmente considerados compostos emergentes nos ecossistemas aquáticos. Estes compostos são bioativos e com diferentes modos de ação, são desenhados para exercer efeitos a baixas concentrações exibindo toxicidade e efeitos secundários a concentrações mais altas. Para a avaliação do risco ecológico destes compostos é necessária uma escolha cuidada das espécies usadas em ensaios ecotoxicológicos. O presente trabalho teve como principal objetivo estudar o uso de planárias de água doce como organismos modelo para a avaliação dos efeitos ecotoxicológicos de compostos como a fluoxetina e carbamazepina. As planárias de água doce são organismos-modelo em estudos neurofarmacológicos sendo que o seu sistema nervoso se assemelha ao de vertebrados. Schmidtea mediterranea é uma das espécies mais bem caracterizadas e usadas para estudos de regeneração e biologia do desenvolvimento. Para além disso, é uma espécie fácil de manter em culturas laboratoriais e usar em ensaios ecotoxicológicos. Este estudo envolveu assim a exposição de organismos, em condições laboratoriais, a baixas concentrações de cada um destes compostos com um enfoque em parâmetros organismais e populacionais. Para além disso e dado que estes compostos ocorrem em misturas complexas nos ecossistemas naturais, foram estudados também os efeitos em cenários relevantes de exposição incluindo a exposição simultânea a outros contaminantes. Em primeiro lugar, a adequabilidade e sensibilidade de diferentes parâmetros ecotoxicológicos em S. mediterranea foram validados em ensaios laboratoriais sendo avaliados os efeitos de tributylestanho (TBT) na locomoção, regeneração e danos do DNA. Desenvolveu-se ainda um ensaio de alimentação que pode ser usado como parâmetro comportamental sensível. Todos os parâmetros mostraram sensibilidade às concentrações testadas e S. mediterranea mostrou ser uma das espécies mais sensíveis ao TBT. Relativamente aos efeitos dos compostos psiquiátricos, os ensaios laboratoriais mostraram que a fluoxetina foi mais tóxica para S. mediterranea que a carbamazepina. A exposição a concentrações baixas de fluoxetina causou genotoxicidade, decréscimos nas taxas alimentares e na reprodução das planárias e também um aumento da atividade locomotora. Por outro lado, e apesar de aumentos na locomoção e dano no DNA observados nas concentrações intermédias, não foram observados efeitos claros da exposição à carbamazepina. Estes resultados realçam a S. mediterranea como um organismo modelo adequado para avaliação de efeitos ecológicos de drogas psiquiátricas em águas doces e também a relevância dos parâmetros usados nestas avaliações. Os ensaios laboratoriais para avaliação de efeitos combinados dos dois compostos psiquiátricos não revelaram interações significativas relativamente aos parâmetros comportamentais nem na reprodução e reforçaram a maior toxicidade da fluoxetina. Relativamente à exposição combinada da fluoxetina com o TBT, usado como modelo para contaminantes neurotóxicos, os resultados revelaram interações significativas e complexas quer para o dano no DNA quer para locomoção das planárias, sugerindo que os efeitos da fluoxetina podem ser alterados pela exposição simultânea ao TBT. No entanto a magnitude dos efeitos causados pelas concentrações usadas quer de TBT quer de fluoxetina convidam a uma investigação mais detalhada acerca dos efeitos combinados de concentrações mais baixas de ambos os compostos. Por último os efeitos de stressores naturais tais como a salinidade na toxicidade da fluoxetina foram investigados. Os níveis de salinidade nos ecossistemas dulçaquícolas têm aumentado devido em parte às alterações climáticas e pressão antropogénica e os nossos resultados mostram que níveis de salinidade baixos (0.75 – 3.0 g NaCl L-1) afetam negativamente as planárias diminuindo as suas taxas alimentares, locomoção e reprodução, atrasando também a regeneração. A exposição combinada a salinidade e fluoxetina revelou efeitos opostos e interações significativas no que respeita à atividade locomotora, sendo que não foram observadas interações significativas para a reprodução. Em conclusão, este estudo sugere que as planárias podem e devem ser usadas como organismos teste para avaliação de risco ecológico dos fármacos psiquiátricos em águas doces, utilizado para isso parâmetros comportamentais, genotoxicidade e reprodutivos