Purifications strategies for polyclonal antibodies from egg yolk

Abstract

Esta tese de doutoramento prende-se com o desenvolvimento de plataformas de purificação mais eficazes para imunoglobulina Y (IgY), anticorpo presente na gema de ovo, visando a sua possível utilização como biofármaco alternativo. Apesar do anticorpo imunoglobulina G (IgG) ser o biofármaco mais utilizado, este apresenta algumas desvantagens, nomeadamente baixos rendimentos de produção e reatividade cruzada com anticorpos humanos ou outras proteínas. Nas últimas décadas, têm sido realizados esforços de modo a utilizar IgY como uma alternativa terapêutica, uma vez que estes anticorpos podem ser obtidos em maiores quantidades e por métodos menos invasivos. No entanto, o custo de produção de IgY com elevada qualidade, e particularmente para aplicações em larga escala, é extremamente elevado quando comparado com outros agentes terapêuticos, o que se deve principalmente à falta de uma estratégia de purificação rentável e eficaz. Assim, o objetivo principal deste trabalho é superar esta grande limitação associada à purificação de IgY. Neste trabalho foi inicialmente realizada uma análise crítica dos métodos de purificação de IgY descritos na literatura, levando à conclusão que são necessários pelo menos dois passos para purificar este anticorpo da gema de ovo. O primeiro passo envolve a remoção de lipídios e lipoproteínas e recuperação da fração de proteínas solúveis em água (FPSA) que contém o anticorpo alvo, seguido da purificação de IgY a partir da FPSA, num segundo ou mais passos. Com base nesta informação, foram posteriormente avaliados dois tipos de métodos de purificação, nomeadamente sistemas aquosos bifásicos (SAB) e sistemas de partição trifásica (SPT). No primeiro tipo de sistemas, onde o objetivo consiste em extrair seletivamente IgY para uma das fases coexistentes, foram estudados sistemas formados por polímeros e sais e por polímeros e líquidos iónicos. O primeiro conjunto de resultados demonstrou que os SAB apresentam baixa seletividade para IgY, especialmente quando considerando a partição preferencial do anticorpo para uma das fases em detrimento das restantes proteínas da FPSA. Por outro lado, a abordagem de partição trifásica, estudada com SAB formados por dois polímeros e líquidos iónicos como eletrólitos, levou a melhores resultados em termos de pureza de IgY, alcançados pela precipitação seletiva do anticorpo alvo na interface do SAB. Sob condições otimizadas, estes sistemas permitiram recuperar IgY com uma pureza superior a 90%. Finalmente, com base no potencial de mercado de IgY como um anticorpo alternativo é também apresentado um plano de negócios preliminar

This PhD work is focused on the development of effective purification platforms for immunoglobulin Y (IgY), antibodies present in high quantities in egg yolk, while foreseeing their widespread use as alternative bio-based therapeutics. Although immunoglobulin G (IgG) antibodies are the most used biopharmaceuticals, they display some disadvantages, namely their low production yields and cross reactivity with human antibodies or other human proteins. In the last decades, some efforts have been placed on the use of IgY as a promising alternative therapeutic option since these can be obtained in higher titters by less stressful and invasive methods. Nevertheless, the production cost of high-quality IgY, particularly for large-scale applications, remains higher than other drug therapies mainly due to the lack of a cost-effective purification strategy. Thus, the main objective of this work is to surpass this major limitation associated to IgY. In this work, a comprehensive and critical analysis of the IgY purification methods described in the literature was first performed. At least two steps are required to purify IgY from egg yolk, the first to remove lipids and lipoproteins and to recover the water soluble-protein fraction (WSPF) that contains the target antibody, followed by the purification of IgY from the WSPF in a second or further steps. Based on this information, two types of purification methods were then investigated, namely aqueous biphasic systems (ABS) and three-phase partitioning (TPP) systems. In the first type of systems, where the goal is to selectively extract IgY for one of the coexisting phases, ABS formed by polymers and salts and by polymers and ionic liquids were investigated. The first set of results demonstrated that ABS have low selectivity for IgY, particularly regarding the preferential migration of IgY for one of the phases over the remaining proteins in the WSPF. On the other hand, the TPP approach, studied with ABS formed by two polymers and ionic liquids as electrolytes, led to better results in terms of IgY purity, achieved by inducing the selective precipitation of the target antibody at the ABS interphase. Under optimized conditions, these systems allow to recover IgY with a purity higher that 90%. Based on the market potential of purified IgY, a preliminary business plan is finally presented