Indução da muda no caranguejo Carcinus maenas L. sob acção hormonal e química

Abstract

O caranguejo Callinectes sapidus (caranguejo azul) tem sido utilizado, nos últimos anos, com enorme sucesso, na produção de caranguejos moles. Nos Estados Unidos da América esta indústria tem apresentado uma enorme expansão, tendo este produto sido considerado uma iguaria de alta qualidade alimentar. Uma vez que o caranguejo Carcinus maenas (caranguejo verde) é extremamente abundante e de fácil captura na Ria de Aveiro, começou a ser estudada a possibilidade de se efectuar a produção de caranguejos moles com esta espécie. Esta produção teria como objectivo colocar no mercado os caranguejos moles quer como produto alimentar (quando em condições óptimas) quer como isco para a pesca desportiva. No entanto, a produção de caranguejo verde não pode ser efectuada com os métodos utilizados na produção de caranguejo azul, isto porque os processos de identificação da fase da muda em ambas as espécies são distintos. Assim, enquanto que no caranguejo azul essa identificação é feita por uma simples e rápida observação directa das patas natatórias (último par de pereópodes), no caranguejo verde é necessário remover-se uma peça bucal (exopódito do 1o maxilípede) para posterior observação ao microscópio óptico. Carvalho et al (1999) realizaram a caracterização da população de Carcinus maenas da Ria de Aveiro tendo-se procurado, sem sucesso, identificar um método mais simples, rápido e não-invasivo de identificação das fases da muda no caranguejo verde. Desta forma, a utilização do caranguejo verde na produção de caranguejos moles seria possível através de uma intervenção no processo fisiológico da muda, ou seja, na pesquisa de um ou mais estímulos que conduzam a uma indução da muda. O controlo do ciclo da muda dos crustáceos é feito maioritariamente através de hormonas da muda (ecdisteróides). Estas apresentam-se como fundamentais para o normal desenrolar do ciclo da muda, sendo por isso bastante importante saber de que forma variam os seus níveis ao longo do ciclo da muda. Para melhor entender as variações dos níveis de ecdisteróides na hemolinfa do caranguejo verde, realizou-se a identificação, separação e quantificação dos ecdisteróides nas diferentes fases do ciclo da muda, utilizando-se para isso a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e o enzimo-imuno-ensaio (EIA). Os ecdisteróides apresentam concentrações baixas nas fases de pós-muda (fase A e B), registando-se aumentos ligeiros na intermuda (fase C) e na fase inicial da pré-muda (fases D0 e D1). No final da pré-muda (D2 e D3) regista-se um aumento significativo das concentrações de ecdisteróides (ANOVA unifactorial, p<005). A 20-hidroxiecdisona foi o ecdisteróide que maiores concentrações apresentou ao longo das diferentes fases da muda, correspondendo os picos mais elevados, à semelhança do verificado nos ecdisteróides totais, às fases finais da pré-muda (D2 e D3). A identificação do perfil de ecdisteróides na hemolinfa do Carcinus maenas permitiu também optimizar as técnicas utilizadas para ser possível a sua futura aplicação em estudos hormonais após a identificação de um estímulo que induza a muda de forma efectiva. Diferentes tratamentos foram utilizados com o intuito de avaliar o seu efeito na sobrevivência e frequência de muda da espécie Carcinus maenas. Resumindo, realizaram-se experiências em que os caranguejos foram expostos ao ar, em que se ablaram ambos os pedúnculos oculares e/ou as patas locomotoras e em que se injectou a hormona da muda activa e/ou compostos químicos com possível inibição da produção/libertação da hormona inibidora da muda. A experiência de exposição ao ar não apresentou nenhum resultado relevante relativamente à frequência de muda. No entanto, ainda no que diz respeito às frequências de muda, verificou-se que os grupos de estudo constituídos pelos animais capturados por arrasto (machos/arrasto e fêmeas/arrasto) apresentaram valores superiores aos que foram capturados com nassas (ANOVA trifactorial, p<0.05). Os períodos de exposição ao ar mais longos (120, 144 e 168h) apresentaram quase sempre as taxas de mortalidade mais elevadas. No entanto, foi em períodos longos de exposição (machos/arrasto - 120h; fêmeas/arrasto - 144h) que se registou a frequência de muda mais elevada (19%). A ablação dos pedúnculos oculares e/ou a ablação de patas locomotoras resultou em frequências de muda superiores nos caranguejos machos do que nas fêmeas (ANOVA trifactorial, p<0.05). Em todos os grupos de estudo, as taxas de mortalidade mais elevadas foram registadas nos caranguejos em que se ablaram ambos os pedúnculos oculares (ANOVA trifactorial, p<0.05). Apesar de, no final da experiência não existirem diferenças significativas entre as frequências de muda observadas, os machos/nassas com ablação de patas locomotoras apresentaram, nos primeiros 15 dias de experiência, uma rápida subida da frequência de muda (de 0 até 22%), tendo estabilizado em seguida até ao final da experiência. Numa tentativa de repetir este resultado, realizou-se um novo ensaio com machos/nassas com ablação de patas locomotoras, mas neste ensaio as frequências de muda registadas foram bastante inferiores. As experiências em que se efectuou a injecção de 20-hidroxiecdisona (20-OHE) e/ou outros compostos químicos com possível influência no ciclo da muda também não permitiram encontrar um estímulo da muda. No ensaio A, as taxas de mortalidade foram extremamente elevadas quer nos controlos (entre 58 e 94%) quer nos animais sujeitos aos diferentes tratamentos (entre 81 e 100%). No ensaio B, os caranguejos foram sujeitos a tratamentos semelhantes (alterou-se apenas as concentrações dos compostos) e apresentaram taxas de mortalidade muito menores (controlos - entre 6 e 13%; tratamentos - entre 17 e 62%). No que diz respeito às frequências de muda, no ensaio A da experiência o número de mudas foi maior nos caranguejos fêmeas do que nos machos, registando-se o contrário no ensaio B. Nas frequências de muda, o valor mais elevado (10%) foi registado em fêmeas (capturadas por arrasto) em que se injectou simultaneamente 20-OHE e ciproheptadina, sem no entanto se mostrar significativamente superior. A impossibilidade de obter um método simples de identificação da fase da muda na espécie estudada (Carcinus maenas) e a variação sazonal das respostas aos diferentes estímulos testados reduziu a aplicabilidade dos resultados obtidos na produção de caranguejo mole. No futuro, o controlo das condições ambientais (fotoperíodo, temperatura e salinidade) como modeladoras da resposta fisiológica deverá ser objecto de uma nova abordagem, a qual poderá eventualmente ser efectuada com uma espécie mais adequada (como o Callinectes sapidus).

The blue crab Callinectes sapidus has been used, in the last years, with great success, in soft crab production. In United States of America this industry showed an enormous expansion, being soft blue crab considered an highly quality food product. Once green crab Carcinus maenas is extremely abundant and easy to capture in Ria de Aveiro, it was studied the possibility of producing soft green crabs with this crab species. The production of soft green grabs objective will be to obtain a high quality alimentary product (when in best conditions) and bate for sport fisherman. However, the methods used in the production of soft blue crabs cannot be applied to green crab because the moult phase identification methods are different. In the blue crab, the moult phase identification is made in a simple and quick way through the direct observation of the swimming legs (last pair of pereiopods). In the green crab, moult phase identification requires the removal of the exopodite of the 1st maxilliped for posterior observation at light microscopy. A previous study on the green crab (Carcinus maenas) population characterization in Ria de Aveiro tried to identify, without success, a simple, fast and non-invasive method of moult phase identification. In this way, the use of green crab in the production of soft crabs would be possible by the intervention on the physiologic process of moult, i.e., in researching one or more stimulus that can induce moult. The moult cycle control in crustaceans is made mainly through the moult hormones (ecdysteroids). These hormones have showed to be crucial for the normal development of the moult cycle, being very important to know how these hormones titers change throughout the moult cycle. For better understanding of these hormones variation in green crab hemolymph, ecdysteroids were identified, separated and quantified in the different moult phases. High performance liquid chromatography (HPLC) and enzimo-immuno-assay (EIA) were the two techniques used to perform this hormonal analysis. Ecdysteroids showed low concentrations in post-moult phases (phases A and B), registering slight increases in intermoult (phase C) and beginning of pre-moult (phases D0 and D-i). The final pre-moult phases (D2 and D3) registered significant higher ecdysteroids concentration in green crab hemolymph (trifactorial ANOVA, p<0.05). 20-Hidroxyecdysone was the ecdysteroid with higher hemolymph concentration throughout the different moult phases, being the highest values, similarly to total ecdysteroids, in the final pre-moult phases (D2 and D3). The ecdysteroid titer identification in Carcinus maenas hemolymph also allowed the optimization of the methods (HPLC and EIA) used for their future utilization in hormonal studies after identification of one stimulus that induce moult effectively. Different treatments were used to evaluate their effect on survival and moult frequency of the crab Carcinus maenas. In this way, some experiments were performed where crabs were exposed to air, eyestalks and/or walking legs were ablated and active moult hormone (20-hydroxyecdysone) and/or other chemical compounds with possible inhibition of moult inhibiting hormone (MIH) production/liberation were injected. The air exposure experiment did not registered relevant results regarding moult induction. However, concerning moult frequency, it was verified that crabs captured by trawl (males/trawl and females/trawl) presented higher values than the ones captured with traps (trifactorial ANOVA, p<0.05). The longest exposure periods (120, 144 e 168h) showed, usually, the highest mortality rates. Nevertheless, it was in longer exposure periods (males/trawl -120h; females/trawl - 144h) that the higher moult frequency value (19%) was registered. Eyestalk ablation and/or walking legs ablation resulted on higher moult frequencies in male than in female crabs (trifactorial ANOVA, p<0.05). In all study groups, highest mortality rates were observed on crabs with eyestalk ablation (trifactorial ANOVA, p<0.05). Although at the end of the experiment the moult frequencies registered were not relevant, males, captured by traps, with walking legs ablation showed, in the first 15 experiment days, a quick increase in the moult frequency (from 0 to 22%), stabilizing since the 15th day until the end of the experiment. A second assay was performed to try to repeat these good results but without success, being registered very low moult frequencies and mortality rates. The experiment where it was injected 20-hidroxyecdysona (20-OHE) and/or other chemical compounds, which possibly interfere in moult cycle, did not presented any stimuli for moult. In assay A, mortality rates were extremely high both in control crabs (between 58 and 94%) and experimental (between 81 and 100%). Meanwhile, in assay B, crabs submitted to similar treatments presented lower mortality rates (controls - between 6 and 13%; treatments -between 17 and 62%). The different mortality rates registered in assay A and B may be due to water physico-chemical variations (temperature, salinity e dissolved oxygen). Regarding moult frequencies, in assay A, it was registered a higher number of moults in female than male crabs; being registered the opposite in assay B (males presented more moults than female crabs). Moult frequencies did not present significant results; however, the simultaneous injection of 20-OHE and cyproheptadine (10%) in females (captured by trawl) registered the highest value of this experiment. The impossibility of an easy identification method of the moult phase in the studied species (Carcinus maenas) and the seasonal variation of the answers to the stimuli tested reduced the applicability of the obtained results in the soft crab production. In the future, the control of the environmental conditions (e.g. photoperiod, temperature and salinity) as modellers of the physiologic response should be object of a new approach, which eventually can be done with a more appropriate species (Callinectes sapidus).