Diversity, cryptic species and sexual strategies in fungi of the order Botryosphaeriales

Abstract

Members of Botryosphaeriales are associated to numerous woody plants all over the world as endophytes or pathogens. From all families composing the order, the Botryosphaeriaceae is the oldest and the largest, containing several genera of relevant phytopathogens. Although it is a fundamental step towards studies on epidemiology and control of a plant disease, correct identification of species in the Botryosphaeriaceae is commonly problematic due to the existence of cryptic species complexes defined by the overlapping of morphological features. Thus, the development of tools to clearly delimit species boundaries is of the utmost importance. This study explored the diversity of Neofusicoccum, one of the largest and most widely distributed genus in the Botryosphaeriaceae, well known by having a large number of cryptic species. Isolates were obtained, not only from relevant forest and crop tree species, but also from less exploited ornamental species. The majority of the isolates obtained belonged to N. eucalyptorum and N. australe but isolates of N. luteum, N. parvum and N. kwambonambiense were also identified. Novel host associations were found, with N. eucalyptorum (a pathogen of Eucalyptus spp.) being reported for the first time on a host outside the family Myrtaceae. Mating type (MAT) genes, which determine sexual identity and control the fungal sexual cycle, were evaluated as molecular markers to delimit species in Neofusicoccum and Diplodia, two genera that contain several cryptic species complexes. For each genus a PCR-based assay was developed in order to easily amplify and sequence the mating type genes. Comparisons between the phylogenetic analyses obtained with MAT genes and the commonly used molecular markers translation elongation factor 1-alpha, internal transcribed spacer of the rDNA and beta-tubulin showed that both MAT genes are able to clearly and reliably delimit all species, thus representing a powerful tool to establish species boundaries, even between closely related cryptic species. Despite their economic and environmental relevance, knowledge about the sexual reproductive (mating) strategies employed by these fungi is very scarce. Here it is shown that homothallism is the predominant strategy among Neofusicoccum species, while being absent in Diplodia where all studied species were shown to be heterothallic. Taking advantage of the available genome sequences of several species belonging to the order Botryosphaeriales, analyses of the genomic organization of MAT loci and their flanking regions were performed. Results showed that heterothallism predominates among members of the order. With few exceptions, genomic organization of the MAT loci and flanking regions revealed some degree of gene synteny between the different families.

Os membros da ordem Botryosphaeriales ocorrem associados a inúmeras plantas lenhosas em todo o mundo como endofíticos ou patogénicos. De todas as famílias que compõem a ordem, a família Botryosphaeriaceae é a mais antiga e a maior, contendo vários géneros fitopatogénicos relevantes. Embora seja um passo fundamental para estudos em epidemiologia e para o controlo de doenças na planta, a correta identificação de espécies na família Botryosphaeriaceae é comumente problemática devido à existência de complexos de espécies crípticas definidos pela sobreposição de características morfológicas. Assim, o desenvolvimento de ferramentas para delimitar de forma clara as espécies é de extrema importância. Este estudo explorou a diversidade de Neofusicoccum, um dos maiores e mais amplamente distribuídos géneros da família Botryosphaeriaceae, reconhecido também por possuir um grande número de espécies crípticas. Os isolados foram obtidos não apenas de espécies florestais e agrícolas relevantes, mas também de espécies menos exploradas como as ornamentais. A maioria dos isolados obtidos pertencia às espécies N. eucalyptorum e N. australe, mas também foram identificados isolados de N. luteum, N. parvum e N. kwambonambiense. Novas associações de hospedeiros foram encontradas, sendo N. eucalyptorum (um patogeno de Eucalyptus spp.) associado pela primeira vez a um hospedeiro não pertencente à família Myrtacea. Os genes que determinam a identidade sexual e controlam o ciclo sexual fúngico (genes MAT) foram avaliados como potenciais marcadores moleculares para delimitar espécies em Neofusicoccum e Diplodia, dois géneros que contêm vários complexos de espécies crípticas. Para cada género foi desenvolvido um protocolo baseado na técnica de PCR para permitir facilmente amplificar e sequenciar os genes MAT. Foram feitas comparações entre as análises filogenéticas obtidas com os genes MAT e os marcadores convencionais factor de alongamento 1-alfa, internal transcribed spacer e beta-tubulina, onde se verificou que ambos os genes MAT permitem delimitar de forma clara e confiável todas as espécies, representando assim uma ferramenta poderosa para estabelecer limites de espécies, mesmo entre aquelas estreitamente relacionadas. Apesar da sua relevância económica e ambiental, o conhecimento sobre as estratégias de reprodução sexual utilizadas por estes fungos é muito escasso. Neste estudo mostra-se que o homotalismo é a estratégia predominante entre as espécies de Neofusicoccum, não tendo sido encontrada em Diplodia, onde todas as espécies estudadas mostraram ser heterotálicas. Aproveitando a disponibilidade de genomas sequenciados de várias espécies pertencentes à ordem Botryosphaeriales, realizaram-se análises da organização genómica dos loci MAT e respectivas regiões flanqueadoras. Os resultados mostraram que o heterotalismo predomina entre os membros da ordem. Com poucas exceções, a organização genómica dos loci MAT e das regiões flanqueadoras revelou algum grau de semelhança entre as diferentes famílias.