Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/22847
Title: Subaquatic sediments as sources of hydrocarbonoclastic and biosurfactant producing facultative anaerobic bacteria
Other Titles: Sedimentos subaquáticos como fontes de bactérias anaeróbicas facultativas hidrocarbonoclásticas e produtoras de biossurfactantes
Author: Domingues, Patrícia Maia
Advisor: Cunha, Angela
Serafim, Luísa Seuanes
Gomes, Newton Carlos Marcial
Keywords: Engenharia química
Hidrocarbonetos - Petróleo
Biossurfactantes
Bactérias anaeróbicas
Hidrocarbonetos - Água do mar - Ria de Aveiro (Portugal)
Defense Date: 25-Jan-2018
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Actualmente são conhecidas poucas estirpes bacterianas capazes de produzir biossurfactantes (BSFs) em condições de microaerobiose ou anaerobiose. Estas bactérias têm um papel importante não só em processos naturais (ex. formação de biofilmes ou de hidratos de gás), como podem ter diversas aplicações biotecnológicas (ex. estratégias de biorremediação e aplicações industriais). As bactérias produtoras de BSFs em condições de limitação de oxigénio, com capacidade para degradar hidrocarbonetos são de particular interesse para estratégias de biorremediação de locais contaminados com hidrocarbonetos de petróleo (PHs) e na recuperação microbiana de petróleo (MEOR). Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e a caracterização de bactérias anaeróbias ou anaeróbias facultativas produtoras de BSF e degradadoras de hidrocarbonetos (hidrocarbonoclásticas) na perspetiva da sua aplicação biotecnológica em condições de limitação de oxigénio. Foram escolhidos dois ambientes contaminados com PHs como potenciais fontes de bactérias hidrocarbonoclásticas produtoras de BSFs: vulcões de lama (MV) de mar profundo do Golfo de Cádis (Oceano Atlântico) e o sistema estuarino da Ria de Aveiro (Portugal). Foram preparadas culturas de enriquecimento com sedimentos subaquáticos recolhidos nestes dois habitats, como potenciais inóculos de bactérias anaeróbias facultativas. Um design experimental fatorial foi usado para testar o efeito do crude como fonte de carbono, e de nitrato e/ou sulfato, como aceitadores terminais de eletrões. De forma a melhor compreender a estrutura das comunidades bacterianas envolvidas na biodegradação de PHs nos MV do mar profundo procedeu-se à sequenciação do gene 16S rRNA das comunidades bacterianas de culturas de enriquecimento com sedimento de dois MVs, um activo e outro inactivo, e com ou sem adição de crude e/ou nitrato. Detetou-se uma diferenciação entre as comunidades dos dois MVs, independentemente dos suplementos a que as culturas foram expostas, sendo que Alphaproteobacteria e Bacilli predominaram nas culturas com sedimentos de MV activo e inactivo, respectivamente. De uma forma menos acentuada, tanto o nitrato como o crude afetaram a composição das comunidades bacterianas. Géneros de bactérias que só foram detectados nos ensaios com adição de crude (ex. Erythrobacteraceae no MV activo e Acidimicrobiale no MV inactivo) poderão ser usados como indicadores da presença de hidrocarbonetos de petróleo nestes habitats. A biodegradação de PHs nas culturas com crude foi avaliada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. De uma forma geral, as comunidades de culturas do MV activo foram capazes de degradar n-alcanos de tamanho inferior a C13 e compostos monoaromáticos, enquanto as comunidades do MV inactivo apresentaram a capacidade de metabolizar vários tipos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. A presença de nitrato apenas afectou positivamente a biodegradação de alcanos, e não teve efeito ou foi mesmo inibitória da biodegradação de outros hidrocarbonetos. A partir de todas as culturas, com todos os tipos de sedimentos, dos MVs do Golfo de Cádis e do estuário da Ria de Aveiro, foi possível isolar-se um total de 13 isolados capazes de sobreviver exclusivamente com crude como fonte de carbono e produzir BSF em condições de aerobiose. Destas, apenas duas não foram capazes de produzir BSFs em anaerobiose. A sequenciação do gene 16S rRNA dos isolados permitiu identifica-los como pertencendo aos géneros Pseudomonas, Bacillus, Ochrobactrum, Brevundimonas, Psychrobacter, Staphylococcus, Marinobacter e Curtobacterium, a maioria dos quais não tinha ainda membros conhecidos como produtores de BSF em anaerobiose. Os resultados obtidos com este trabalho permitiram caracterizar melhor as comunidades envolvidas na degradação de PHs em MVs de mar profundo. Conseguiu-se ainda isolar e identificar estirpes, tanto de mar profundo como de ambiente estuarino, capazes de degradar PHs e produzir BSFs em condições de anaerobiose. Estas estirpes apresentam elevado potencial biotecnológico para aplicações como MEOR e biorremediação em ambientes com escassez de oxigénio.
So far, only few bacterial strains are known to produce biosurfactants (BSFs) under microaerobic or anaerobic conditions. However, these bacteria are not only involved in important natural processes (e.g. biofilm and gas hydrates formations) but can also be used in several biotechnological applications (e.g. bioremediation strategies and industrial applications). Bacteria able to produce BSFs under oxygen-limiting conditions that are also able to degrade hydrocarbons, are of particular interest to bioremediation strategies of sites contaminated with petroleum hydrocarbons (PHs) and microbial enhanced oil recovery (MEOR) strategies. In this context, this work aims at isolating, identifying, and characterizing BSF-producing and hydrocarbon-degrading (hydrocarbonoclastic) bacteria grown under anaerobic conditions, which can be used in biotechnological applications under oxygen limitation. Two environments contaminated with PHs were chosen as potential sources of hydrocarbonoclastic BSF-producing bacteria: deep-sea mud volcanos from the Gulf of Cadiz (Atlantic Ocean), and the estuarine system of Ria de Aveiro (Portugal). Enrichment cultures were prepared using subaquatic sediments from both sites, as potential sources of facultative anaerobic bacteria. A factorial experimental design was used to test the effect of crude oil as carbon source, and nitrate and/or sulfate, as terminal electron acceptors. Aiming at better understanding the structure of bacterial communities involved in PHs biodegradation at deep-sea MVs, sequencing of the 16S rRNA gene was performed for bacterial communities from cultures containing sediments from two MVs, active and inactive, and with or without crude oil and/or nitrate. A distinction between the communities of MVs with different activity, independent of the supplements was observed. Alphaproteobacteria and Bacilli were the predominant classes found in enrichment cultures inoculated with active and inactive MVs sediments, respectively. In a minor scale, nitrate and crude oil additions also affected the composition of bacterial communities. Therefore, genera that only appeared in cultures with crude oil. (e.g. Erythrobacteraceae in active MV cultures and Acidimicrobiale in inactive MV cultures) can be used as biosensors of the presence of PHs in these habitats. Biodegradation of PHs in cultures containing crude oil was assessed by gas chromatography coupled with mass spectrometry. Overall, communities from active MV cultures were able to degrade n-alkanes below C13 and monoaromatic hydrocarbons, while communities from inactive MV cultures presented the ability to metabolize several types of polycyclic aromatic hydrocarbons. The presence of nitrate only had a positive effect on the biodegradation of alkanes, and had no effect or even an inhibitory effect on the biodegradation of other hydrocarbons. A total of 13 isolates able to survive on crude as carbon source and produce BSF under aerobic conditions were obtained from all cultures either from sediments of the Gulf of Cadiz MVs or the estuarine system of Ria de Aveiro. Only two isolates failed to produce BSF under anaerobiosis. Sequencing of 16S rRNA gene was used to establish the identification of isolates as Pseudomonas, Bacillus, Ochrobactrum, Brevundimonas, Psychrobacter, Staphylococcus, Marinobacter and Curtobacterium. Most of these genera had never been described as able to produce BSFs under anaerobic conditions. The results obtained in this work allowed to better characterize the deep-sea communities involved in PHs degradation, as well as, to identify strains from deep-sea and estuarine sediments able to degrade PHs and produce BSFs under anaerobic conditions. These bacteria present high biotechnological potential for applications in oxygen-limiting environments, such as, MEOR and bioremediation of environments contaminated with PHs.
Description: Doutoramento em Engenharia Química
URI: http://hdl.handle.net/10773/22847
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