New approaches to control and detect enterotoxic Staphylococcus aureus strains

Abstract

With 25 million cases of foodborne diseases occurring annually worldwide, food safety is a major concern. Despite considerable efforts to improve food safety, outbreaks of foodborne diseases due to the presence of pathogenic microorganisms, such as Staphylococcus aureus, are well described in the literature. S. aureus is a well-adapted opportunistic pathogen, which is able to grow in numerous types of food, producing an extensive number virulence factors, including enterotoxins, which are responsible for staphylococcal food poisoning. This type of food poisoning is one of the most prevalent foodborne diseases in the world. With an increased demand for safer food, new food preservation technologies have been developed. Among these technologies is high pressure processing (HPP), which is a non-thermal food preservation method that enables the inactivation or control of pathogenic microorganisms and microorganisms responsible for food spoilage, maintaining food properties. The quick and specific detection of pathogenic microorganisms (or of microorganisms responsible for food spoilage) has become increasingly important in the food industry. Usually the detection, and identification of bacteria is performed using traditional methods based on biochemical and/or serological tests and also on molecular methods based on DNA or RNA analysis. However, these methods are costly, time consuming and laborious. Consequently, it is necessary to develop new alternative methods, such as those based on microbial metabolomics, which can be used as a tool to detect microorganisms in the food industry. Microbial metabolomics uses the metabolites released by microorganisms, being able to allow not only the detection and distinction of microbial species, but also the distinction of their strains. One of the objectives of this work was to evaluate the efficacy of HPP treatment for the inactivation of non-enterotoxic and enterotoxic S. aureus strains. Thus, to accomplish this objective, 1) the effectiveness of different treatments (different pressures and holding times were evaluated); 2) the impact of the treatments on virulence factors, fermentation of mannitol and methicillin susceptibility was evaluated; 3) the development of resistance along several successive HPP cycles was evaluated, and 4) the recovery capacity after 14 days of treatment was also assessed. Other objective of this study was to characterize the volatile exometabolome of S. aureus and evaluate its potential to distinguish the enterotoxic strains from the non-enterotoxic strain. For this purpose, 1) the profile of the volatile exometabolome of S. aureus was characterized using an advanced gas chromatography technique; 2) the S. aureus profile was analyzed as a whole and evaluated the presence of specific compounds already described for this species as well as its metabolic origin; 3) a multivariate statistical analysis method was applied in order to obtain a set of volatile compounds responsible for the distinction of the three strains used; and 4) these set of volatile compounds were analyzed in detail in order to explain the differences between strains, thus justifying their separation. The results of inactivation by HPP showed a higher barotolerance of the non-enterotoxic strain (ATCC 6538), not being completely inactivated at 600 MPa for 30 minutes (maintaining a viability of approximately 4 Log CFU.mL-1). The two enterotoxic strains (2153 MA and 2065 MA) were completely inactivated using these treatment conditions. Both strains ATCC 6538 and 2153 MA (with an enterotoxin) were able to withstand 10 successive pressurization cycles, whereas the strain 2065 MA (with three enterotoxins) was completely inactivated after 4 cycles, with a decrease of 9.2 log CFU.mL-1. The HPP treatment did not affect none of the tested virulence factors, the mannitol fermentation ability and methicillin susceptibility of any of the strains. Moreover, none of the strains were able to recover their viability after 14 days of incubation in any of the treatment cycles. The study of the volatile exometabolome of S. aureus allowed the detection of 240 volatile organic compounds, belonging to 10 chemical families, having as main metabolic origins the degradation of amino acids, the metabolism of pyruvate and oxidative stress. It was also possible to find 10 of the most reported volatile compounds in studies concerning the volatile exometabolome of S. aureus. The detailed analysis of the volatile exometabolome allowed selecting 10 volatile compounds that have been reported more frequently in other studies concerning the volatile exometaboloma of S. aureus. The multivariate statistical analysis, allowed to distinguish the strains based on the number (or absence) of enterotoxins. The strains ATCC 6538 and 2153 MA are more similar to each other, being separated from the strain 2065 MA. This distinction is due to the latter strain has larger amounts of volatile compounds, resulting from the degradation of branched-chain amino acids, while the strain ATCC 6538 showed higher amounts of volatile compounds with origin in the degradation of methionine. In conclusion, the results showed that HPP is effective in the control of S. aureus, not allowing the development of resistance or recovery of viability after successive treatments. Although the virulence factors were not affected by HPP treatment, the enterotoxic strains were more easily inactivated than the non-enterotoxic strain. It was also concluded that the volatile exometabolome of S. aureus is quite complex and that the exometabolome analysis allows to distinguish enterotoxic strains from non-enterotoxic strains. It was possible to select a set of 10 compounds that can be potentially used as biomarkers of S. aureus.

Anualmente, em todo o mundo, existem 25 milhões de casos de doenças transmitidas por alimentos fazendo com que a segurança alimentar seja um tópico de grande importância. Apesar do esforço considerável para melhorar a segurança alimentar, a incidência de intoxicações e infeções transmitidas por alimentos é ainda bastante elevada. Staphylococcus aureus é uma bactéria patogénica oportunista que possui a capacidade de crescer em vários tipos de alimentos, bem como a capacidade de produzir um grande número de fatores de virulência, incluindo enterotoxinas, as quais são responsáveis pela intoxicação alimentar estafilocócica. Esta é uma das doenças alimentares mais predominante a nível mundial. Com o aumento da procura de alimentos mais seguros, têm sido desenvolvidas novas tecnologias para a sua preservação. Entre essas tecnologias encontra-se o processamento por alta pressão (PAP), que é um método não térmico que possibilita a inativação ou o controlo de microrganismos patogénicos e de microrganismos responsáveis pela deterioração dos alimentos, ao mesmo tempo que mantém as propriedades dos alimentos. A deteção rápida e específica de microrganismos patogénicos (ou de microrganismos que podem provocar deterioração de alimentos) tornou-se cada vez mais importante na indústria alimentar. Atualmente, para detetar e identificar bactérias são utilizados métodos tradicionais baseados em testes bioquímicos e/ou serológicos e também em métodos moleculares baseados em análise de DNA ou RNA. No entanto, estes métodos são dispendiosos, demorados e/ou laboriosos. Consequentemente, é necessário desenvolver novos métodos alternativos como por exemplo, com base na metabolómica microbiana, que pode ser explorada como ferramenta para deteção de microrganismos na indústria alimentar. A metabolómica microbiana utiliza os metabolitos libertados pelos microrganismos, podendo permitir não apenas a deteção e distinção de espécies microbianas mas também das suas estirpes. Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar a eficácia do tratamento por PAP, na inativação de estirpes não enterotóxicas e enterotóxicas de S. aureus. Deste modo, foi 1) avaliada a eficácia dos diferentes tratamentos (diversas pressões e tempos de pressurização); 2) avaliado o impacto dos tratamentos nos fatores de virulência, na capacidade de fermentação do manitol e na suscetibilidade à meticilina; 3) avaliado o desenvolvimento de resistência após vários ciclos sucessivos de PAP, e 4) avaliada a capacidade de recuperação da viabilidade após 14 dias de tratamento. Neste trabalho também se caracterizou o exometaboloma volátil de S. aureus e avaliou o seu potencial para distinguir as estirpes enterotóxicas de não enterotóxica. Assim, 1) o perfil do exometaboloma volátil de S. aureus foi caracterizado utilizando uma técnica avançada de cromatografia em fase gasosa; 2) o perfil de S. aureus foi analisado no total, avaliando a presença de compostos específicos já descritos para esta espécie bem como a sua origem metabólica; 3) aplicou-se um método de análise estatística multivariada, de forma a obter um conjunto de compostos voláteis de forma a distinguir as diferentes estirpes, nomeadamente distinguir as estirpes enterotóxicas das não enterotóxicas; e 4) este conjunto de compostos voláteis foi analisado em detalhe de forma a compreender as diferenças entre estirpes e assim justificar a sua distinção. Os resultados da inativação por PAP mostraram maior barotolerância da estirpe não enterotóxica (ATCC 6538), não sendo esta completamente inativada a 600 MPa durante 30 minutos (mantendo uma viabilidade de aproximadamente 4.0 log UFC.mL-1). Utilizando estas condições de tratamento, as duas estirpes enterotóxicas (2153 MA e 2065 MA) foram completamente inativadas. Tanto a estirpe ATCC 6538 como a estirpe 2153 MA (com uma enterotoxina) suportaram 10 ciclos de pressurização sucessivos, contrariamente à estirpe 2065 MA (com três enterotoxinas) que foi totalmente inativada ao fim de 4 ciclos, com um decréscimo de 9.2 log UFC.mL-1. O tratamento por PAP não afetou os fatores de virulência testados, nem a capacidade de fermentação do manitol e a suscetibilidade à meticilina de nenhuma das estirpes. Nenhuma das estirpes foi capaz de recuperar a viabilidade após 14 dias de incubação, em nenhum dos 10 ciclos de tratamento. O estudo do exometaboloma volátil de S. aureus permitiu detetar 240 compostos, pertencentes a 10 famílias químicas, tendo como principal origem metabólica a degradação de aminoácidos, o metabolismo do piruvato e o stresse oxidativo. A análise em detalhe do exometaboloma volátil permitiu selecionar 10 compostos voláteis que têm sidomais frequentemente reportados noutros estudos sobre o exometaboloma volátil de S. aureus. Após análise estatística multivariada, foi possível distinguir as estirpes testadas com base no número (ou na ausência) de enterotoxinas. As estirpes ATCC 6538 e 2153 MA são mais similares entre si, encontrando-se separadas da estirpe 2065 MA. Esta distinção deve-se ao facto desta última estirpe produzir maiores concentrações de compostos voláteis resultantes da degradação de aminoácidos de cadeia ramificada, enquanto a estirpe ATCC 6538 produz maiores concentrações de compostos voláteis resultantes da degradação da metionina. Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram que o tratamento por PAP é eficaz para controlar estirpes enterotóxicas de S. aureus, não permitindo o desenvolvimento de resistência nem a recuperação da viabilidade após tratamentos sucessivos. Embora os fatores de virulência não tenham sido afetados pelo tratamento por PAP, as estirpes enterotóxicas foram mais facilmente inativadas quando comparadas com a estirpe não enterotóxica. Concluiu-se ainda que o exometaboloma volátil de S. aureus é bastante complexo e que através do estudo do exometaboloma é possível distinguir estirpes enterotóxicas de estirpes não enterotóxicas. Foi possível selecionar um conjunto de 10 compostos que poderão potencialmente vir a ser utilizados como biomarcadores da presença de S. aureus.