CD44-glicoprofilling: establishing the molecular basis for target therapeutics in bladder cancer

Abstract

O cancro da bexiga (BC) apresenta uma das maiores taxas de recorrência entre os tumoures sólidos e é a segunda causa de morte, relativamente a doenças do trato geniturinário. A introdução de modelos moleculares para um melhor prognóstico e desenvolvimento de terapias dirigidas efetivas, continua a ser um aspeto desafiador devido à significativa heterogeneidade molecular inter e intratumoral. No entanto, a CD44, uma proteína de membrana fortemente O-glicosilada e envolvida nas interações célula-célula, adesão celular e migração, parece desempenhar um papel crítico na progressão e disseminação do cancro da bexiga, abrindo portas para potenciais terapêuticas dirigidas. No entanto, o gene que codifica esta proteína geralmente sofre splicing alterativo, o que resulta em diversas isoformas funcionalmente distintas, de pesos moleculares variáveis e com vários locais de glicosilação. No entanto, a natureza dessas isoformas no contexto do cancro da bexiga ainda não está bem esclarecida. Com base nestas ideias, este trabalho tem como objetivo determinar as isoformas da CD44 mais clinicamente relevantes e com potencial de direcionar para clones mais agressivos. É dado particular ênfase à identificação de O-glicanos associados ao cancro, que visam aumentar o entendimento molecular para o desenho de ligandos altamente específicos. Consequentemente observou-se que a CD44 está aumentada na urina de doentes com cancro de bexiga, comparativamente com urinas controlo de indivíduos saudáveis. Esse efeito é mais pronunciado em estadios avançados da doença, particularmente após a invasão muscular, o mesmo se verifica com expressão da CD44 nos tumores de bexiga. Além disso, uma abordagem direcionada por RT-PCR demonstrou que o modelo celular de tumores superficiais de cancro da bexiga, a linha celular 5637 e os tumores de bexiga não invasivos sobre-expressam isoformas da CD44 de alto peso molecular (CD44v3-10high, CD44v8-10high, CD44slow). Por outro lado, as linhas celulares T24 e HT1376 derivadas de tumores musculo-invasivos e estes mesmos tumores sobre-expressam predominantemente CD44s, uma isoforma de menor peso molecular (CD44v3-10low, CD44v8-10low, CD44shigh). Além disso, os clones quimiorresistentes das células T24, tratadas com cisplatina, também sobre-expressam CD44s. Da mesma forma, os tumores invasores apresentaram um fenótipo semelhante, apoiando a associação da CD44 com fenótipos mais agressivos. Os estudos de glicómica e glicoproteómica envolvendo a linha celular T24 demonstraram ainda a expressão de CD44 glicosilado com antigénios sialil-Tn (CD44-STn) e di-sialil-T (dST), anteriormente associados a um pior prognóstico. Em paralelo, ensaios de imuno-histoquímica e de ligação de proximidade in situ confirmaram a existência de CD44-STn e CD44-dST em tumores musculo-invasivos. Em conclusão, CD44s, possivelmente modificada com STn e dST, tem o potencial de direcionar selectivamente para células mais agressivas de tumores de bexiga e clones quimiorresistentes, estabelecendo assim as bases moleculares para o desenho de ligandos. Estudos futuros devem-se concentrar em avaliar o impacto funcional da remodelação da CD44 para isoformas de menor peso molecular, acompanhando a transição de tumores superficiais para invasores.

Bladder Cancer (BC) presents one of the highest recurrence rates amongst solid tumours, and constitutes the second deadliest disease of the genitourinary track. The introduction of molecular models for disease management and effective targeted therapeutics remains a challenging aspect due to significant inter and intra-tumour molecular heterogeneity. Nevertheless, CD44, a heavily O-glycosylated membrane protein involved in cell-cell interactions, cell adhesion and migration has been suggested to play a critical role in bladder cancer progression and dissemination, holding potential for targeted therapeutics. However, the gene encoding for CD44 generally undergoes significant alterative splicing, which results in many functionally distinct isoforms of variable molecular weights and glycosylation sites. Nevertheless, the nature of these isoforms in bladder cancer are yet to be fully disclosed. Building on these insights, this work aims to highlight clinically relevant CD44 isoforms with potential for targeting more aggressive clones. Particular emphasis is also given to the identification of cancer-associated O-glycans envisaging the molecular rational for designing highly specific cancer ligands. Accordingly, it was observed that CD44 is increased in the urine of bladder cancer patients in relation to healthy controls. This effect is more pronounced for advanced stages of the disease, particularly upon muscle invasion, mimicking CD44 expression in bladder tumours. Moreover, a targeted approach by RT-PCR demonstrated that superficial bladder cancer cell model 5637 and non-invasive bladder tumours overexpress high molecular weight CD44 isoforms (CD44v3-10high, CD44v8-10high, CD44slow phenotype). Conversely, T24 and HT1376 cell lines derived from muscle invasive tumours and invasive lesions predominantly overexpress lower molecular weight isoform CD44s (CD44v3-10low, CD44v8-10low, CD44shigh phenotype). In addition, chemoresistant clones from T24 cells challenged with cisplatin also overexpressed CD44s. Likewise, bladder tumours from patients with invasive tumours presented a similar phenotype, supporting CD44s association with more aggressive phenotypes. Glycomics and glycoproteomics studies involving T24 cell line further demonstrated the expression of CD44 glycosylated with sialyl-Tn (CD44-STn) and di-sialyl-T (dST) antigens, previously associated with poor prognosis. In parallel, immunohistochemistry and in situ proximity ligation assays confirmed the existence of CD44-STn and CD44-dST in muscle invasive tumours. In conclusion, CD44s, possibly modified with cancer-associated STn and dST glycans, holds potential to selectively target more aggressive bladder cancer lesions and chemoresistant clones, setting the molecular rational for ligands design. Future studies should now focus on disclosing the functional impact of CD44 remodelling towards lower molecular weight isoforms, accompanying transition from superficial to invasive lesions.