O impacto metabólico da expressão individual e conjunta dos oncogenes KRAS e MYC em murganhos com pancreatite e cancro pancreático

Abstract

O cancro pancreático (PC) corresponde à quarta principal causa de morte tumoral, sendo que a incidência desta doença é muito próxima à taxa de mortalidade a ela associada. O prognóstico para indivíduos com PC tem evoluído muito lentamente nas últimas décadas, devido ao avanço limitado nos métodos de diagnóstico e terapias. Sabe-se que o PC é caracterizado por alterações em 5 principais genes, sendo os oncogenes o KRAS e o MYC os mais relacionados com este tipo de cancro. Têm assim sido utilizados modelos de murganhos geneticamente modificados com a finalidade de descobrir os possíveis agentes moleculares envolvidos no desenvolvimento e progressão do PC. O presente trabalho utilizou a metabolómica por espetroscopia de RMN de 1H, para caracterizar as alterações metabólicas resultantes de pancreatite (condição benigna) e do efeito da presença e ativação dos oncogenes KRAS e MYC no tecido pancreático de murganhos transgénicos. Para tal, na primeira parte (murganhos wild-type e modelo KRAS) analisaram-se extratos aquosos de pâncreas (n=41) e, numa segunda parte (modelos MYC e KRAS), extratos aquosos (n=82) e lipídicos (n=71) do mesmo orgão. Inicialmente, verificou-se que o perfil metabólico da pancreatite se distinguiu do tecido normal (alteração dos níveis de alanina, creatina, formato, fumarato, AMP, UMP, niacinamida, fenilacetato, GSH e ATP), e também do tecido com lesões neoplásicas PanIN de baixo grau (alteração dos níveis de alanina, creatina, fenilalanina e UDP-glucose ou –glucuronato). Além disso, verificou-se que a ativação do gene KRAS tem elevada influência nas alterações metabólicas que acompanham a evolução das lesões neoplásicas PanIN e o desenvolvimento dos tumores pancreáticos adenocarcinoma ductal e carcinoma sarcomatóide. A progressão da carcinogénese pancreática caracterizou-se pela diminuição de glutamina, 2-fosfoglicerato, fosfocolina, fosfoetanolamina, glicerofosfocolina e UDP-glucose ou –glucuronato e pelo aumento de 3-HBA, ascorbato, lactato, niacinamida, glucose e sacarose. Os dois tipos de tumor não apresentaram diferenças metabólicas significativas entre si. Na segunda parte do trabalho, verificou-se que o efeito da ativação individual do oncogene MYC promoveu mais alterações metabólicas do que a ativação conjunta dos oncogenes MYC e KRAS no metabolismo pancreático. A ativação do MYC caracterizou-se pela diminuição de glutamina, hipotaurina, isoleucina, compostos derivados da uridina e ácidos gordos e pelo aumento de glutamato, prolina, succinato e colesterol. A ativação do mesmo oncogene, na presença do KRAS, promoveu a diminuição de fosfocolina e glicerofosfocolina e o aumento de glutamina, GSH e succinato. Desta forma, concluiu-se que a metabolómica é uma estratégia promissora para a definição de biomarcadores metabólicos para o diagnóstico da pancreatite e dos vários estadios do PC.

Pancreatic cancer (PC) is the 4th leading cause of tumor death its incidence approaching the levels of mortality associated with this disease. The prognosis for individuals with PC has evolved very slowly in the last decades due to the limited progress in methods of early diagnosis and therapy. It is known that PC is characterized by changes in 5 main genes, and the oncogenes most frequently affected are named KRAS and MYC. Therefore, genetically engineered mouse models have began to be used in order to discover the possible molecular agents involved in the development and progression of PC. The work within this thesis involved 1H-NMR-based metabolomics to characterize the metabolic changes ocurring in pancreatic tissue due to the benign condition of pancreatitis and, in transgenic mice, due to the presence and activation of KRAS and MYC oncogenes. In the first part of this work (wild-type mice and KRAS model), pancreatic aqueous extracts (n = 41) were analyzed and, in the second part (MYC and KRAS models), aqueous (n = 82) and lipidic extracts (n = 71) of the same tissue. Firstly, it was verified that the metabolic profile of pancreatitis was distinguished from normal tissue (changed levels of alanine, creatine, formate, fumarate, AMP, UMP, niacinamide, phenylacetate, GSH and ATP) and from tissue with low grade neoplastic lesions PanIN (changed levels of alanine, creatine, phenylalanine and UDP-glucose or –glucuronate). In addition, the activation of the KRAS gene has been shown to have a high influence on the metabolic changes during the evolution of neoplastic lesions PanIN and the development of pancreatic ductal adenocarcinoma and sarcomatoid carcinoma. Progression of pancreatic carcinogenesis was characterized by decreased levels of glutamine, 2-phosphoglycerate, phosphocholine, phosphoethanolamine, glycerophosphocholine and UDP-glucose or -glucuronate, and increased levels of 3-HBA, ascorbate, lactate, niacinamide, glucose and sucrose. No significant metabolic differences were observed between the two types of tumor. In the second part of this work, the individual activation of MYC oncogene was shown to promote more metabolic changes than the combined activation of MYC and KRAS oncogenes in the pancreatic metabolism. Activation of MYC was characterized by decreased levels of glutamine, hypotaurine, isoleucine, uridine derived compounds and fatty acids and by the increased levels of glutamate, proline, succinate and cholesterol. Activation of the same oncogene in the presence of KRAS promoted the decrease of phosphocholine and glycerophosphocholine and the increase of glutamine, GSH and succinate. These results show that metabolomics may be significantly useful to define metabolic biomarkers of pancreatitis and of PC onset and progression.