Emerging antifouling biocides: the search for more environment-friendly chemicals

Abstract

Antifouling (AF) systems are used worldwide to prevent biofouling, a natural phenomenon characterized by the attachment and growth of living organisms onto submerged surfaces. Biofouling may lead to elevated economic losses not only due to the deterioration of submerged structures but also, in the case of vessels, to the increase of frictional drag that ultimately results in the rise of fuel consumption and the reduction of the vessel´s operational time. The hulls chemical protection against this phenomenon has been a common practice in the naval industry but the leaching of biocides from AF systems into the aquatic environment has frequently caused severe adverse ecological impacts. Therefore, it is critical to search for more environment-friendly AF biocides, valuing the compromise of having a good AF performance to target organisms and the lowest ecological impact. Organotin compounds (OTs), especially tributyltin (TBT) and to a lesser extent triphenyltin (TPT), have been used as biocides in AF paints from the 1960's until their ban in 2008. As a consequence, a number of other compounds emerged as substitutes. There was a return to predominantly copper based AF paints with one or more booster biocides added to the formulations to achieve a maximum performance. These alternatives comprised diuron, irgarol 1051, zinc pyrithione, tolylfluanid and dichlofluanid among others. However, some of them have also been banned or phased out from the market due to their toxic effects to aquatic organisms. One objective of the present thesis was to assess the current levels of these AF biocides along the Portuguese coast. For this purpose, a survey was performed in 2011 where both sediments and tissue samples from the mediterranean mussel Mytillus galloprovincialis were collected and analysed to determine the extent of the above mentioned biocides contamination. It was also assessed the imposex levels in the gastropod Nucella lapillus as a proxy to evaluate the status of TBT pollution. The tissues of this bioindicator were also analysed for OTs due to the proven cause-effect relationship between imposex and TBT/TPT body burden. The results reveal that despite the OT global ban in 2008, TBT was still ubiquitous being measured in all assessed sediment samples (3.0 – 850 ng Sn g-1 dry weight (dw)) and in both mussel (1.1 – 420 ng Sn g-1 dw) and dogwhelk tissues (1.4 – 30.4 ng Sn g-1 dw). TPT was less abundant as it was detected in approximately 50 % of the samples: concentration in sediments varied between the detection limit (dl) of 0.1 and 43 ng Sn g-1 dw; in mussel tissues ranged between the dl of 0.2 and 14 ng Sn g-1 dw; in dogwhelk tissues varied from the dl of 0.2 to 1.6 ng Sn g-1 dw. The percentage of N. lapillus females affected by imposex (%I), the vas deferens sequence index (VDSI) and the relative penis size index (RPSI) were used to measure the intensity of imposex and varied between 36.7 – 100%, 0.39 – 7.75 and 0 – 1.22, respectively. Sterile females were only found at one site. Despite the TBT ubiquity in the Portuguese coast, with major incidence close to naval harbours, a decreasing temporal trend of organotin pollution has been observed; in fact, the comparison of 2011 results with those from previous years denote an evident decline of TBT contamination of sediments and biota (namely, mussels and dogwhelks) and N. lapillus imposex. This survey also detected Cu, Zn and diuron in both sediments and mussel tissues. Although the metals have natural and wide anthropogenic sources and diuron may also come from pesticide use in agriculture, the results may point towards their ubiquitous use in AF-paints in a recent past. In the sediments, Cu, Zn and diuron varied between 1.7 and 240 mg Kg-1 dw, the dl of 10 and 620 mg Kg-1 dw and 7.7 and 67 ng g-1 dw, respectively. In mussel tissues Cu varied between 4 and 11 mg Kg-1 dw, Zn between 94 and 640 mg Kg-1 dw and diuron ranged from the dl of 3 to 20 ng g-1 dw. Seldom it was also detected irgarol - measured in 6 (out of the 13) sampled sediment stations (6.8 – 43 ng g-1 dw) and in 5 (out of the 37) mussel tissue samples (18.7 – 183 ng g- 1 dw) - and its metabolite GS26575 measured in only one sediment sample (41 ng g-1 dw) and varying between 4.1 and 188 ng g-1 dw in 4 (out of 37) mussel tissue samples. Tolylfluanid was only measured in 3 (out of 13) sediment samples (9.4 – 21.9 ng g-1 dw) and in 2 (out of 37) mussel tissues samples (5.3 and 26.8 ng g-1 dw). Dichlofluanid content in mussel tissues varied between 2.3 - 160 ng g-1 dw occurring in 5 (out of 37) stations whilst in sediments was always below the detection limit. Nonetheless, contrasting with TBT spatial distribution, no specific pattern could be clearly recognized on the distribution of these AF biocides. With the implementation of the new Biocidal Product Regulation (EU Regulation 528/2012), emerging substances aiming to present a high AF potential to target organisms and a low environmental impact arose. A low toxicity to non-target species as well as a low tendency to bioaccumulate and a rapid transformation to less toxic products are required characteristics of environment-friendly biocides. For this thesis a bibliographic research was carried out in order to select emerging biocides with promising properties. Three biocides were chosen: tralopyril, triphenylborane pyridine (TPBP) and capsaicin. Tralopyril is the main active substance of ECONEA®, being marketed as a non-persistent and biodegradable copper-free biocide, effective in controlling fouling by barnacles, hydroids, mussels and polychaetas. TPBP, also known as Borocide®, is an organoborane compound used as a broadspectrum biocide mainly in Japan. Capsaicin is a natural occurring substance, derived from the chili pepper plant commonly used as animal repellent and claimed to improve the paint efficiency. Therefore, most of the work of this thesis comprehended the characterization of some aspects of the PBT (Persistence, Bioaccumulation and Toxicity) criteria of these biocides in order to perform a proper ecological risk assessment. Giving the scarcity of data in the literature, the major objective of this thesis was to gather new data about the toxicity of tralopyril, TPBP and capsaicin to freshwater and marine organisms, in order to provide novel insights regarding the potential impact of these chemicals to aquatic ecosystems. Regarding the marine environment, a study with early life stages of target and non-target species was carried out. It showed that the tested biocides impaired larval development in the mussel M. galloprovincialis (EC50_tralopyril = 3.1 μg L-1 and EC50_capsaicin = 3868 μg L-1) inhibited larval growth in the sea urchin P. lividus (EC50_tralopyril = 3.0 μg L-1 and EC50_capsaicin = 5248 μg L-1) and caused mortality to the copepod T. battagliai (EC50_tralopyril = 0.9 μg L-1, EC50_capsaicin = 1252 μg L-1 and EC50_TPBP = 14 μg L-1) in a dose-dependent way. When comparing the risk posed by these three emerging biocides with TBT, a reference AF substance, in a seawater marina model, it was concluded that the three tested compounds pose less risk than TBT but, nevertheless, tralopyril and TPBP might represent a considerable threat to the marine ecosystems. Capsaicin was described as the least toxic compound, apparently with no risk but also not presenting a high biocide performance. The next step was to characterize the toxicity of tralopyril, TPBP and capsaicin to three freshwater model species: the algae Chlamydomonas reinhardtii, the crustacean Daphnia magna and the fish Danio rerio. The lethal effects of the three biocides were studied for all the aforementioned species whilst sub-lethal effects were only assessed for the algae and zebrafish. Tralopyril was the only biocide that caused mortality to C. reihardhtii (LC50 = 71 μg L-1). In the D. magna acute immobilization test, tralopyril and TPBP revealed similar toxicities but only if the concentrations were mantained constant by means of solution renewal. To the zebrafish, tralopyril was undoubetly the most lethal (LC50 = 5.0 μg L-1) followed by TPBP (LC50 = 447.5 μg L-1). Capsaicin did not exert any lethal effects to any of the species tested. Regarding sub-lethal toxicity, both tralopyril and TPBP caused significant effects on C. reihardhtii effective quantum yield and ATP content, however TPBP was much less toxic. Concerning zebrafish, TPBP inhibited the swim bladder inflation, caused heart edema, reduced the blood flow and, at the highest concentrations, led to a diminish of the heart beat rate, whilst tralopyril only caused an inhibition of the swim bladder inflation though at much lower concentrations. Capsaicin caused an increase on the zebrafish embryo heart beat rate although not in a doseresponsive way. The results herein provided data on the effects of the three emerging biocides on freshwater ecosystems but also, as these species belong to different trophic levels, it helped to reduce the assessment factor used in risk assessment, decreasing the uncertainty of such prediction. Thus, the risk assessment performed for a freshwater marina corroborated previous investigations where capsaicin was identified as an environment-friendly compound whilst tralopyril and TPBP were identified as possible threats to the ecossystem. In order to have some insights into the mode of action of the two most toxic compounds referred above - tralopyril and TPBP - further investigations using a differential proteomic analysis were carried out. Sub-lethal tralopyril and TPBP concentrations regulated both general stress-related and compoundspecific proteins on the zebrafish embryo proteome. The common protein regulations between compounds are thought to be stress-related changes and comprehended the altered expression of proteins involved in energy metabolism, eye structure and in cell differentiation processes. Sub-lethal tralopyril exposure specifically upregulated six other proteins involved in energy metabolism, cytoskeleton, cell division and mRNA splicing whilst exposure to TPBP comprised the regulation of three proteins belonging to the cytoskeleton, cell growth and protein folding. Moreover, calculations on the toxic ratio of both compounds identified TPBP as a baseline toxicant whilst tralopyril was found to have a specific toxicity mode of action. As tralopyril became an important candidate to be used in European waters (due to its inclusion on the Biocidal Product Regulation) and also because this biocide revealed the highest and more specific overal toxicity, additional studies were undertaken to better understand the persistence and bioaccumulation potential of this compound. For that, it was essential to develop a sensitive analytical method to measure tralopyril in aqueous matrices. Therefore, a targeted analytical LC-MS/MS method was established to quantify tralopyril in DMSO (the solvent used in all studies portrayed in this thesis) and water samples (natural river and seawater, and medium used for zebrafish exposures - E3 medium). The limits of quantitation achieved for the different media are sufficiently low to detect tralopyril without a preconcentration step (0.05 μg L-1 for river water and 0.025 μg L-1 for the other media analysed). Estimated tralopyril half-lives were 6.1 h for seawater, 8.1 h for river water and 7.4 h for E3 medium at 18º C. In order to study the bioaccumulation potential, tralopyril concentrations were measured in the whole tissues of M. galloprovincialis following acute and chronic exposure, and after a 10-day depuration period. This biocide rapidly accumulated in the mussel tissues, reaching the steady-state condition within 13 days. Nevertheless, mussels seemed to be able to eliminate the compound since 10 days of depuration resulted in 80% elimination of the accumulated biocide. In order to further understand the sub-lethal toxicity of tralopyril to M. galloprovincialis and the possible mode of action, differential proteomics analysis was performed on the gill proteome of this species following acute and chronic exposure, and after a 10-day depuration period. Interestingly, not only tralopyril but also DMSO (used as solvent) significantly modulated the protein expression in mussel gils after acute and chronic exposure. Altogether, 46 proteins involved in bioenergetics, immune system, active efflux and oxidative stress were found to be regulated in the different exposure scenarios. Notably, after the depuration period, alterations of several proteins were still observed possibly reflecting either the continued effect or the incomplete elimination of this chemical. In conclusion, this thesis shows a change in the paradigm regarding AFbiocides, i.e., moving from older generation biocides with high ecological risk, to new ones that should desirably present low persistence and no impact to nontarget species, a difficult task that involves perseverance and hard work.

Os sistemas anti-vegetativos (AV) são usados mundialmente para evitar a incrustação biológica, um fenómeno natural caracterizado pela fixação e crescimento de organismos vivos em superfícies submersas. A bioincrustação pode levar a elevadas perdas económicas, não só devido à deterioração de estruturas submersas, mas também, no caso de navios, ao aumento da resistência à deslocação que resulta num acréscimo do consumo de combustível e na redução do tempo de vida operacional do navio. A proteção química dos cascos dos navios, contra este fenómeno, tem sido uma prática comum na indústria naval, mas a lixiviação de biocidas dos sistemas AV no meio aquático tem frequentemente causado impactos ecológicos adversos graves. Portanto, é fundamental procurar biocidas AV, mais amigos do ambiente, valorizando o compromisso entre ter um bom desempenho AV para atingir organismos alvo mas com um menor impacto ecológico. Os compostos organoestânicos (OTS), especialmente o tributil-estanho (TBT) e, em menor medida o trifenil-estanho (TPT), têm sido utilizados como biocidas em tintas AV desde a década de 1960 até à sua proibição em 2008. Como consequência, uma série de outros compostos surgiram como substitutos. Houve um retorno predominante ao uso de tintas AV à base de cobre com um ou mais biocidas de reforço adicionados às formulações, para alcançar um desempenho máximo. Estas alternativas incluíram diuron, Irgarol 1051, piritiona de zinco, tolilfluanida e diclofluanida entre outros. No entanto, alguns deles também foram proibidos ou retirados do mercado devido aos seus efeitos tóxicos para os organismos aquáticos. Um dos objectivos da presente tese foi avaliar os níveis destes biocidas AV presentes ao longo da costa Portuguesa. Com esta finalidade, foi realizado um estudo científico, em 2011, onde foram recolhidas e analisadas amostras de sedimentos e de tecido de mexilhão (Mytillus galloprovincialis) para determinar a extensão da contaminação pelos biocidas acima mencionados. Foram também avaliados os níveis de imposex no gastrópode Nucella lapillus como forma de verificar o estado da poluição por TBT. Os tecidos deste bioindicador foram somente analisados para o conteúdo de organoestânicos devido à relação causa-efeito já comprovada entre imposex e o conteúdo de TBT / TPT nos tecidos. Os resultados revelaram que, apesar da proibição mundial de OTs, em 2008, o TBT continua disseminado por toda a costa, sendo detetado em todas as amostras de sedimento (3.0 - 850 ng Sn g-1 peso seco (ps)) e também em amostras de tecidos de mexilhão (1.1 - 420 ng Sn g-1 ps) e do gastrópode N. lapillus (1.4 - 30.4 ng Sn g-1 ps). O TPT é menos abundante, uma vez que apenas foi detectado em cerca de 50% das amostras: a concentração nos sedimentos variou entre o limite de detecção (ld) de 0.1 e 43 ng Sn g-1 ps; a concentração nos tecidos de mexilhão variaram entre o ld de 0.2 e 14 ng Sn g-1 ps; a concentração em tecidos do gastrópode variaram entre o ld de 0.2 e 1.6 ng Sn g-1 ps. A percentagem de fêmeas do gastrópode N. lapillus afectadas por imposex (% I), o índice de sequência de vaso deferente (VDSI) e o índice de tamanho relativo do pénis (RPSI) foram usadas para medir a intensidade do imposex e variaram entre 36.7 - 100%, 0.39 - 7.75 e 0 - 1.22, respectivamente. Fêmeas estéreis foram encontradas apenas numa estação de amostragem. Apesar da ubiquidade do TBT no litoral Português, com maior incidência perto de portos navais, foi observada uma tendência temporal decrescente da poluição por organoestanhos; efetivamente, a comparação dos resultados de 2011 com os de anos anteriores denotam uma diminuição evidente da contaminação por TBT não só nos sedimentos e biota (tanto em tecidos de mexilhão como de gastrópodes) mas também no imposex de N. lapillus. Nesta pesquisa também foi detectada a presença de Cu, Zn e diuron em ambas amostras de sedimento e tecidos de mexilhão. Embora os metais possam provir de várias fontes, tanto naturais como antropogénicas, e o diuron possa advir da utilização de pesticidas na agricultura, estes resultados sugerem o uso ubíquo destes biocidas em tintas AV num passado recente. Nos sedimentos, Cu, Zn e diuron variaram entre 1.7 e 240 mg kg-1 ps, entre o ld de 10 e 620 mg kg-1 ps e 7.7 e 67 ng g-1 ps, respectivamente. Em tecidos de mexilhão o Cu variou entre 4 e 11 mg kg-1 ps, Zn entre 94 e 640 mg kg-1 ps e diuron variou desde o ld de 3 a 20 ng g-1 ps. Raramente foram ainda detectados Irgarol – medido em 6 (das 13) estações de sedimentos amostrados (6.8 - 43 ng g-1 ps) e em 5 (das 37) amostras de tecido de mexilhão (18.7 - 183 ng g-1 ps) – e o seu metabolito GS26575 medido em apenas uma amostra de sedimento (41 ng g-1 ps) e variando entre 4.1 e 188 ng g-1 ps em 4 (das 37) amostras de tecido de mexilhão. Tolilfluanida só foi medido em 3 (de 13) amostras de sedimentos (9.4 - 21.9 ng g-1 ps) e em 2 (de 37) amostras de tecido de mexilhão (5.3 e 26.8 ng g-1 ps). O conteúdo de diclofluanida em tecidos de mexilhão variaram entre 2.3 e 160 ng g-1 ps ocorrendo em 5 (de um total de 37) estações, enquanto nos sedimentos esteve sempre abaixo do limite de detecção. No entanto, contrariamente à evidente distribuição espacial do TBT, a distribuição destes biocidas na costa portuguesa não apresentou um padrão específico. Com a implementação do novo Regulamento dos Produtos Biocidas (Regulamento da UE 528/2012), surgiram algumas substâncias emergentes cujo propósito é apresentar um elevado potencial AV para organismos alvo e baixo impacto ambiental. A baixa toxicidade para espécies não-alvo, bem como uma baixa tendência de bioacumulação e uma rápida transformação para produtos menos tóxicos são características necessárias de biocidas mais amigos do ambiente. Para esta tese foi realizada uma pesquisa bibliográfica, a fim de selecionar compostos emergentes com propriedades promissoras. Três biocidas foram escolhidos: tralopyril, trifenilborano piridina (TPBP) e capsaicina. Tralopyril é a principal substância ativa do produto ECONEA®, comercializado como um biocida livre de cobre, não persistente e biodegradável, eficaz no controle da proliferação de cracas, hidrozoários, mexilhões e poliquetas. TPBP, também conhecido como Borocide®, é um composto organoborano usado como biocida de largo espectro, principalmente, no Japão. A capsaicina é uma substância natural, derivada da planta da pimenta utilizada como repelente de animais e que adicionada às tintas AVs alegadamente melhora a sua eficácia. Assim, a maior parte do trabalho desta tese compreendeu a caracterização de alguns aspectos dos critérios PBT (Persistência, Bioacumulação e Toxicidade) destes biocidas, a fim de realizar uma avaliação adequada do risco ecológico. Devido à escassez de dados na literatura, o principal objetivo desta tese foi reunir novos dados sobre a toxicidade do tralopyril, TPBP e capsaicina tanto em organismos marinhos como de água doce, a fim de proporcionar novos conhecimentos sobre o potencial impacto desses produtos químicos nos ecossistemas aquáticos. Relativamente ao ambiente marinho, foi realizado um estudo com estádios iniciais de vida de espécies-alvo e não-alvo. Observou-se que os biocidas testados comprometeram o desenvolvimento larvar do mexilhão M. galloprovincialis (EC50_tralopyril = 3.1 μg L-1 e EC50_capsaicina = 3868 μg L-1) inibiram o crescimento larvar do ouriço do mar P. lividus (EC50_tralopyril = 3,0 μg L-1 e EC50_capsaicina = 5248 μg L-1) e causaram mortalidade no copépode T. battagliai (EC50_tralopyril = 0,9 μg L-1, EC50_capsaicina = 1252 μg L-1 e EC50_TPBP = 14 μg L-1) em função da dose usada. Ao comparar o risco ambiental apresentado pelos três biocidas emergentes com o do TBT, uma substância AV de referência, num modelo de marina de água salgada, concluiu-se que os três compostos testados apresentam menor risco que o TBT. No entanto, tanto o tralopyril como o TPBP podem representar uma ameaça considerável para os ecossistemas marinhos. A capsaicina parece ser como o composto menos tóxico, aparentemente, sem risco mas também sem um alto desempenho biocida. O passo seguinte foi caracterizar a toxicidade do tralopyril, TPBP e capsaicina em três espécies modelo de água doce: a alga Chlamydomonas reinhardtii, o crustáceo Daphnia magna e peixe-zebra Danio rerio. Os efeitos letais dos três biocidas foram estudados para todas as espécies acima mencionadas, enquanto que os efeitos sub- letais foram avaliados apenas para as algas e peixe-zebra. Tralopyril foi o único biocida que causou mortalidade na alga C. reihardhtii (LC50 = 71 μg L-1). No teste agudo de imobilização da D. magna, tralopyril e TPBP revelaram toxicidades semelhantes, mas somente se as concentrações fossem mantidas constantes por meio de renovação da solução. Para o peixe-zebra, tralopyril foi sem dúvida o composto mais letal (LC50 = 5.0 μg L-1) seguido pelo TPBP (LC50 = 447.5 μg L-1). A capsaicina não exerceu quaisquer efeitos letais em nenhuma das espécies testadas. Em relação à toxicidade sub-letal, tanto o tralopyril como o TPBP causaram efeitos significativos no rendimento quântico efetivo e no conteúdo de ATP em C. reihardhtii, no entanto o TPBP apresentou uma toxicidade bastante mais baixa. Em relação ao peixe-zebra, o TPBP inibiu a inflação de bexiga natatória, causou edema no coração, reduziu o fluxo sanguíneo e, nas concentrações mais elevadas, levou a uma diminuição da taxa de batimento cardíaco, enquanto que o tralopyril causou apenas uma inibição da inflação de bexiga natatória embora numa concentração bastante menor. A capsaicina causou um aumento na taxa de batimentos cardíacos do embrião de peixe-zebra, embora de uma forma não dependente da concentração do composto. Os resultados aqui descritos não só proporcionam informação sobre os efeitos dos três biocidas emergentes sobre os ecossistemas de água doce, mas também, uma vez que estas espécies pertencem a níveis tróficos diferentes, ajudou a reduzir os factores de avaliação utilizados na avaliação de risco, diminuindo a incerteza de tal previsão. Assim, a avaliação de risco realizada para uma marina de água doce corroborou investigações anteriores, em que a capsaicina foi identificada como um composto amigo do ambiente, enquanto que o tralopyril e o TPBP foram identificados como possíveis ameaças ao ecossistema. Com a finalidade de compreender o modo de ação dos dois compostos mais tóxicos, acima referidos - tralopyril e TPBP - novas investigações foram efectuadas usando uma analise proteómica diferencial. Concentrações subletais de tralopyril e TPBP regularam tanto proteínas relacionadas com o stress geral do organismo, como também outras proteínas mais especificas da ação do composto, no proteoma do embrião de peixe-zebra. Pensa-se que a regulação de proteínas comuns entre compostos possa ser relacionada com o stress e abrangeram a alteração de proteínas envolvidas no metabolismo energético, estrutura do olho e processos de diferenciação celular. A exposição a concentrações sub-letais de tralopyril regularam positivamente seis proteínas específicas envolvidas no metabolismo da energia, do citoesqueleto, da divisão celular e no splicing do mRNA, enquanto que a exposição a TPBP levou à regulação de três proteínas pertencentes ao citoesqueleto, crescimento celular e protein folding. Foram ainda efectuados cálculos sobre o Toxic Ratio de ambos os compostos que identificaram o TPBP como um químico responsável por uma toxicidade mais geral, enquanto que o tralopyril parece ter um modo de ação mais específico.Uma vez que o tralopyril se tornou num candidato importante a ser utilizado em águas europeias (devido à sua inclusão no Regulamento dos Produtos Biocida) e também porque este composto revelou a mais alta e específica toxicidade, de entre os 3 biocidas, foram realizados estudos adicionais para compreender melhor a sua persistência e potencial de bioacumulação. Para isso, foi essencial desenvolver um método analítico sensível para medir este composto em matrizes aquosas. Assim, um método analítico por LC-MS/MS foi estabelecido para quantificar tralopyril em DMSO (o solvente utilizado em todos os estudos realizados nesta tese) e em amostras aquosas (águas naturais de rio e do mar, bem como o meio utilizado nas exposições de embriões de peixezebra - Medio E3). Os limites de quantificação do tralopyril nos vários meios utilizados foram suficientemente baixos para detectar tralopyril sem um passo de pré-concentração (0.05 μg L-1 para águas do rio e 0.025 μg L-1 para os outros meios de analisados). O tempo de meia-vida estimado para este composto foi de 6.1 h na água do mar, 8.1 h na água de rio e 7.4 h no meio E3 a 18º C. A fim de estudar o potencial de bioacumulação, foram medidas as concentrações de tralopyril em tecidos de M. galloprovincialis após exposição aguda e crónica, e após um período de depuração de 10 dias. Este biocida acumulou rapidamente nos tecidos de mexilhão, atingindo o estado estacionário em 13 dias. No entanto, pensa-se que os animais sejam capazes de eliminar o composto uma vez que 10 dias de depuração resultaram na eliminação de 80% do biocida acumulado. Com o objectivo de melhor compreender a toxicidade sub-letal do tralopyril em M. galloprovincialis e o modo de ação deste composto, foi realizada uma análise proteómica diferencial no proteoma das brânquias de organismos desta espécie após exposições aguda e crónica e depois de um período de depuração de 10 dias. Curiosamente, não só o tralopyril mas também o DMSO (utilizado como solvente), modularam significativamente a expressão de proteínas nas brânquias de mexilhão após exposições aguda e crónica. No total, 46 proteínas envolvidas na bioenergética, no sistema imunológico, active efflux e no stress oxidativo foram reguladas nos diferentes cenários de exposição. Alterações de várias proteínas foram ainda observadas, depois do período de depuração, possivelmente refletindo quer o efeito contínuo do tralopyril ou da sua eliminação incompleta. Em conclusão, este trabalho mostra uma mudança de paradigma em relação aos biocidas AV, isto é, há uma passagem do uso de biocidas mais antigos com alto risco ecológico, para biocidas mais novos que devem, desejavelmente, apresentar uma baixa persistência e nenhum impacto para as espécies não alvo, uma tarefa difícil que envolve perseverança e trabalho árduo.