Development of multicelular 3D cancer testing platforms for evaluation of new anti-cancer therapies

Abstract

O cancro do pulmão (CP) é um dos cancros mais diagnosticados a nível mundial e também um dos mais mortíferos. Atualmente, as terapias administradas a nível clínico para o tratamento do CP são ainda extremamente ineficazes e limitadas no que diz respeito ao aumento da taxa de sobrevivência dos pacientes oncológicos. Esta realidade demonstra a necessidade de investigar ativamente novas terapias para o tratamento desta neoplasia. No entanto a validação pré-clínica de terapias inovadoras para o CP tem-se revelado extremamente difícil devido à inexistência de plataformas que sejam adequadas para testes a nível laboratorial, uma vez que as culturas celulares in vitro bidimensionais (2D), recomendadas pelas agências regulatórias são incapazes de mimetizar as caraterísticas principais dos tumores humanos. Estas limitações têm originado uma fraca correlação entre a performance das terapias nos estudos in vitro e a obtida em ensaios clínicos controlados. Neste contexto, os modelos de tumores tridimensionais (3D) in vitro têm vindo a ser reconhecidos como uma solução para este problema, pois podem recapitular várias componentes do microambiente tumoral. Das várias plataformas 3D in vitro de CP investigadas atualmente muito poucas avaliaram o papel da inclusão de células estaminais mesenquimais (MSCs). Para colmatar esta lacuna, o trabalho de investigação desenvolvido no âmbito desta dissertação descreve a produção e otimização de novos modelos hétero-celulares 3D in vitro. Estas plataformas são compostas por células tumorais do CP (A549) e do seu estroma, nomeadamente fibroblastos da pele e células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs). Estes três tipos de células foram co-cultivadas em micropartículas poliméricas de policaprolactona revestidas por ácido hialurónico, com o objetivo de incluir este componente da matriz extracelular que se encontra presente no microambiente do CP. Esta abordagem permitiu formar a nível laboratorial microtecidos multicelulares 3D híbridos que melhor mimetizam a heterogeneidade celular das neoplasias pulmonares. Os resultados obtidos demonstraram que os microtumores formados através da técnica de sobreposição-líquida são reprodutíveis em termos de morfologia e tamanho, apresentaram núcleos necróticos, organização celular 3D e produziram proteínas do microambiente tumoral. Além destas caraterísticas, os dados obtidos através de microscopia de fluorescência revelaram que as BM-MSCs migram para o interior dos microtumores ao longo do tempo. A avaliação da citotoxicidade da Doxorubicina, um fármaco anti-tumoral rotineiramente utilizado a nível clínico, demonstrou que a inclusão de micropartículas aumenta a resistência das células tumorais em modelos homotípicos. Nos modelos tri-cultura heterotípicos a citotoxicidade foi comparável à obtida em microtumores sem micropartículas. Estes resultados evidenciam assim o papel importante dos fibroblastos e das BM-MSCs na resposta dos microtumores. Numa visão global, os modelos 3D formados recapitulam com mais exatidão o microambiente do cancro do pulmão e poderão servir no futuro como plataformas de teste para descobrir ou aperfeiçoar novas terapias, ou combinações de terapêuticas, para este tipo de neoplasia.

Lung cancer (LC) is one the most commonly diagnosed cancers worldwide, being also one of the deadliest. Currently, clinically administered therapies for treatment of LC are still extremely ineffective and limited in increasing oncologic patients survival rates. This reality evidences the necessity of actively investigating novel therapies for the treatment of LC. However, preclinical validation of novel therapies as revealed itself as an extremely arduous process, due to the lack of suitable laboratory testing platforms since the recommend in vitro bi-dimensional (2D) cell cultures are unable to fully mimic the main hallmarks of human tumors. In this context, in vitro tridimensional (3D) tumor models are being increasingly recognized as a solution due to their ability to correctly recapitulate several characteristics of the tumor microenvironment (TME). Amongst currently developed 3D in vitro platforms for the study of LC, few have included or studied the role of mesenchymal stem cells (MSCs). To provide further insights into this hypothesis, the research work developed in this thesis describes the production and optimization of novel heterotypic in vitro 3D models, comprised by non-small-cell lung cancer cells (A549) and stromal cells, namely skin fibroblasts (HFs), and bone-marrow derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs). These three diverse cell populations were co-cultured in hyaluronic acid coated polymeric polycaprolactone microparticles (LbL-MPs) as to include this key extracellular matrix component of LC TME. This approach allowed the formation of 3D multicellular heterotypic microtissues (3D-MCTS) that better recapitulate the cellular heterogeneity of LC TME in the laboratory. The obtained findings demonstrate that these models formed via the liquid-overlay technique were reproducible in terms of morphology and size, presented necrotic core formation, 3D cellular organization, and deposited matrix proteins in a similar manner as in the TME. Besides this, fluorescence microscopy data revealed that BM-MSCs migrated overtime into the microtumors core . Performed doxorubicin in vitro cytotoxicity assays revealed that the inclusion of LbL-MPs lead to an increased resistance of homotypic A549 monoculture models against this anti-cancer drug commonly used in clinical treatments. Alongside, the cytotoxicity obtained in triculture heterotypic models was comparable to that of microtumors without LbL-MPs inclusion, showcasing the role of HFs and BM-MSCs in microtumors response to therapy. Globally, the herein bioengineered 3D models were able to recapitulate with an increased precision the TME of LC, making them suitable test platforms for development or improvement of standalone or combinatorial therapies for this type of neoplasia.