Development of injectable hydrogels derived from human platelest lysates

Abstract

A medicina regenerativa e a engenharia de tecidos surgiram como alternativas para as terapias atualmente usadas no tratamento e substituição de tecidos ou órgãos lesados. Estas novas terapias combinam o uso de materiais sintéticos ou biológicos ou uma combinação de ambos por forma a produzir um tecido com a mesma estrutura e funcionalidade do original, contribuindo para o tratamento de tecidos e órgãos lesados. No tecido nativo, as células estão rodeadas por uma matriz extracelular que fornece suporte mecânico e biológico às mesmas. Hidrogéis são redes poliméricas com elevado conteúdo de água que podem ser injetados de uma maneira pouco invasiva, reticulando in situ. As suas propriedades mecânicas, físico-químicas e biológicas podem ser ajustadas e controladas, fazendo com que estes se tornem fortes candidatos a simular a matriz extracelular encontrada in vivo e a fornecer suporte para o crescimento celular. O papel do plasma rico em plaquetas (PRP) e dos lisados de plaquetas humanas (PL) na fabricação de hidrogéis e também como fonte de fatores de crescimento já se encontra descrito. Contudo, os hidrogéis até agora descritos apresentam fracas propriedades mecânicas, são degradados rapidamente e têm um elevado grau de contração. Assim sendo, o principal objetivo deste projeto é a fabricação de um hidrogel a partir de PL, com propriedades mecânicas aumentadas e adaptáveis, estáveis in vitro e in vivo. PL metacrilatados (PLMA) resultaram da modificação dos PL com anidrido metacrílico. Quando expostos à radiação ultravioleta os PLMA são capazes de formar hidrogéis por polimerização radicalar. Foram obtidos dois diferentes graus de modificação: PLMA100 (baixo grau de modificação) e PLMA300 (elevado grau de modificação). A caracterização mecânica dos hidrogéis mostrou que estes têm propriedades mecânicas aumentadas, influenciadas pelo grau de modificação e pela concentração de PLMA. Imagens obtidas por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) demonstraram que o grau de modificação e a concentração de PLMA influenciam a porosidade do hidrogel. Baixas concentrações de PLMA apresentam poros mais largos do que elevadas concentrações e ainda o PLMA300 apresenta uma porosidade bastante apertada. Também foram realizados ensaios de libertação de proteína os quais demonstraram uma libertação sustentada de proteína por parte do hidrogel. Ensaios de cultura celular in vitro foram realizados por forma a avaliar o desempenho biológico dos hidrogéis. Células L929 e células estaminais adiposas humanas (hASCs) foram encapsuladas no hidrogel e os resultados demonstram que a viabilidade celular é mantida durante pelo menos 7 dias. Os resultados obtidos para a quantificação de DNA também demonstram que estes hidrogéis suportam a proliferação celular. Com este trabalho foi possível obter hidrogéis com um elevado conteúdo proteico que podem ser usados como plataforma para cultura celular. Na era atual, tendo em conta a medicina personalizada e a terapia direcionada, estes materiais autólogos poderão ser aplicados na biomedicina, nomeadamente na engenharia de tecidos, reduzindo problemas como rejeição de tecidos, resposta imune e também problemas éticos.

Regenerative medicine and tissue engineering (TE) are emerging as alternatives for the currently used therapies to heal or replace injured tissues and organs. TE therapies use synthetic or biological materials or a combination of both in order to produce a tissue with the same structure and functionality as the original one and this way contribute to tissue healing. In vivo, cells are surrounded by an extracellular matrix (ECM) that provides mechanical and biological support for cells. Hydrogels are soft and water-rich polymeric networks that can be injected in a minimal invasive manner and reticulate in situ. Their mechanical, physiochemical and biological properties can be easily tuned, which makes them ideal candidates to mimic the ECM and support cell growth. The role of platelet rich plasma (PRP) and human platelet lysates (PL) to fabricate hydrogels and as a source of growth factors (GFs) has been previously reported. However, the materials so far reported, suffer from weak mechanical properties, rapid biodegradation and high degree of contraction. Therefore, the main goal of this project was the fabrication of a 3D PL hydrogel, with increased and tunable mechanical properties and in vitro and in vivo stability. Methacryloyl platelet lysates (PLMA) were achieved by modification of PL with methacrylic anhydride (MA). PLMA when exposed to UV irradiation are capable of forming hydrogels by radicalar polymerization. Two different modifications were made: PLMA100 (low-modification degree) and PLMA300 (high-modification degree). Mechanical characterization demonstrate that PLMA hydrogels have increased mechanical properties, influenced by PLMA modification degree and also by the concentration. Scanning electron microscopy (SEM) images demonstrated the influence of modification degree and PLMA concentration in porous network. Lower concentration of PLMA showed large porous than higher concentrations and PLMA300 showed really tight porous. PLMA protein release assays were also performed, demonstrating an overall sustained protein release from the hydrogel. In vitro cell culture assays were performed in order to evaluate biological performance of PLMA hydrogel. L929 cells and human adipose-derived stem cell (hASCs) were encapsulated within the hydrogels and for both cell types results showed that cell viability is maintained for at least 7 days. DNA quantification demonstrated that produced hydrogels support cell proliferation. In this work we were capable to obtain hydrogels from a human source with high protein content, which can be used as a platform for cell culture. In the current era, striving toward personalized medicine and targeted therapy, these type of autologous materials will certainly find applications in biomedical applications, namely tissue engineering strategies, reducing problems like tissue rejection, immune response and also reduces ethical and regulatory issues.