Visão de profundidade em microscopia óptica para detecção de anomalias em tecidos biológicos

Abstract

A visualização tridimensional de uma anomalia num tecido biológico constitui um problema prático em diagnóstico clínico. A escolha de medidas terapêuticas depende do conhecimento mais preciso da localização e de outras características morfológicas da patologia. A informação tridimensional é produzida através do processamento de uma pilha de imagens digitalizadas do objecto em análise, obtidas a diferentes níveis de profundidade de campo, num microscópio óptico equipado com varrimento vertical. Apesar de comercialmente se encontrarem disponíveis vários métodos de reconstrução tridimensional de objectos a partir de imagens bidimensionais adquiridas em planos axiais onde a dimensão linear do objecto é da gama do cm, pouca informação se encontra disponível nas condições limite de visualização de patologias a nível celular. É de notar que a espessura típica do glóbulo vermelho é da ordem de grandeza do mícron e dimensão de estruturas sub celulares da gama dos sub-mícron. Este trabalho foi motivado pelo problema prático de interpretação clínica das inclusões citoplasmáticas em glóbulos vermelhos, denominadas de pontuado basófilo, observados em imagens de esfregaços de sangue de pacientes com patologia associada à deficiência de P5’N. As imagens foram obtidas em microscopia óptica de elevada resolução. O principal objectivo da dissertação apresentada consiste na avaliação de desempenho de algoritmos de desconvolução para reconstrução tridimensional a partir de uma pilha de imagens referentes a planos axiais de células de glóbulos vermelhos com estruturas patológicas. Foram estudadas duas classes de algoritmos, algoritmos iterativos e não iterativos. O procedimento de desconvolução necessita do conhecimento prévio da resposta impulsional do sistema de formação de imagem (Point-Spread-Function - PSF). Foram testados dois procedimentos diferentes para determinação da PSF. Num dos casos, a PSF foi extraída de pequenas estruturas visíveis na própria imagem e, no outro, foram usadas PSFs teóricas de parâmetros variáveis. A eficiência dos algoritmos foi primeiro testada em dados obtidos por simulação do processo de formação de imagem sobre dados sintéticos, tendo em conta que objectos experimentais com estruturas na gama dos sub-mícron não se encontravam disponíveis. Os resultados do estudo mostram que, apesar das estruturas analisadas serem da ordem de grandeza do comprimento de onda da luz, os algoritmos iterativos optimizados podem contribuir para a melhoria do contraste global das imagens e em alguns casos são conseguidas estimativas da profundidade relativa das estruturas anómalas. No sentido de fornecer informação adicional ao estudo foram efectuadas estimativas de parâmetros morfológicos do pontuado basófilo.

Visualization in three dimensions of an anomaly in the body or in the tissue is an important problem in clinical diagnostics; the choice of the therapeutic measures depends upon the reliable knowledge of the localization and other geometrical features of the pathology. The three-dimensional information is produce by processing a digitalized stack of 2-D images taken at different levels of depth through the sample, on an optical microscopy system. Though many methods are commercially available for reconstructing the object in 3-D from the two dimensional images taken at various axial sections, in the cases the typical linear dimension of the object is in the cm range, very little information is available when the challenge is to visualize the pathologies at the cellular level. It is to be recalled that the typical thickness of a red blood cell is in the micron range and the pathologies in the cell are in the submicron region. The work was motivated by a practical problem of understanding the clinical implications of geometrical features of basophilic stippling that is observed in the high resolution optical microscopy images of blood smear of patients with pyrimidine 5'-nucleotidase deficiency. The main objective of the thesis presented here is to analyse the effectiveness of some of the available deconvolution algorithms in reconstructing the pathological features of a red blood cell from a Z-stack of the X-Y images. Two classes, iterative and non iterative, of algorithms were studied. The deconvolution procedure necessitates the availability of Point Spread Function (PSF). Two different kinds of procedures for PSF were tested. In one case PSF was extracted from the smallest visible feature in the image itself and in another case a theoretical PSF with the possibility of varying the parameters was used. The effectiveness of the algorithms was tested on data obtained by simulating the imaging process on synthetic objects since suitable phantom objects with submicron features were not available. The results of the study show that despite the fact that features are of the order of the wavelength of the probing light, optimised iterative algorithms can contribute to the enhancement of the global contrast of the images and some clinically useful estimates of the relative depths of the anomalies can also be made. Additionally, some relevant statistical parameters of the geometry of the stippling were also determined.