Mechanomodulation of chondrogenic differentiation of msesenchymal stem cells

Abstract

A cartilagem hialina, cujas células especializadas são os condrócitos, encontra-se maioritariamente presente nas articulações. A degeneração deste tecido está associada a envelhecimento e a diversas doenças como artrite reumatóide e osteoartrite. Recentemente, tem sido investigada a possibilidade de desenvolver terapias celulares para o tratamento destas patologias, utilizando células estaminais mesenquimais (MSCs). As MSCs têm capacidade para se diferenciar em várias linhagens, incluindo condrócitos, apresentando-se como um dos mais promissores tipos celulares em medicina regenerativa. Nos últimos anos as vias de sinalização iniciadas pelos estímulos mecânicos do meio envolvente – mecanotransdução - tem sido alvo de estudo. Apesar dos mecanismos de diferenciação condrogénica não serem completamente conhecidos, tem-se tornado evidente que a mecanotransdução desempenha um papel crucial neste processo. Foi recentemente demonstrado que as MSCs têm “memória mecânica” e que, se cultivadas por mais de 10 dias num substrato rígido perdem a multipotência. Vários estudos utilizando células primárias ou MSCs apontam a rigidez ótima para diferenciação condrogénica deste 1 kPa até 320 MPa, dependendo do tipo de células e plataforma utilizados. Este estudo propôs-se então a clarificar qual a rigidez ótima para diferenciação condrogénica de MSCs. No presente estudo, foram preparados vários substratos de PDMS e caracterizados por reologia, apresentando módulos de Young que variam entre 21 kPa e 0.9 kPa. A diminuição da área nuclear nos substratos menos rígidos permitiu validar que estes substratos são capazes de induzir um estímulo mecânico. Somente células de baixa passagem foram induzidas a diferenciar diminuir o impacto da memória mecânica. A coloração de Safranin O (SO) permitiu evidenciar que a formação de aglomerados celulares – típica da condrogénese – é favorecida pelo substrato de 1 kPa. Recorrendo à fluorescência deste corante, foi possível estabelecer um método semi-quantitativo para avaliar diferenciação condrogénica de MSCs. Este ensaio indica que o substrato de 1 kPa potencia a diferenciação condrogénica de MSCs. Apesar dos resultados de SO requererem uma validação mais exaustiva por RT-PCR, os resultados preliminares apontam o que a rigidez ótima para diferenciação condrogénica de MSCs é de 1 kPa

Hyaline cartilage is composed by specialized cells named chondrocytes. It is mainly present on joints. Its degeneration is associated not only with ageing, but also with diseases like osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Cell therapy is an emerging concept for these diseases. Mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into various cell lineages, including chondrocytes. Recent studies indicate the significance of how cells are capable of sensing mechanical stimuli and initiate signaling cascades – mechanotransduction. Although the mechanisms are not totally understood, it is known that mechanotransduction plays a significant role during chondrogenesis. “Mechanical memory” is an emerging concept: it has been demonstrated that cells lose their multipotency if cultured on stiff substrates for more than 10 days. Distinct studies using primary cells or MSCs indicate that optimal matrix stiffness for chondrogenic differentiation is between 1 kPa and 320 MPa, depending on cell type and platform used. On the present study, we aimed to elucidate the optimal stiffness for chondrogenic differentiation of MSCs. Various PDMS substrates were produced and characterized by rheology, presenting Young’s modulus between 21 kPa and 0.9 kPa. We verified a decreasing tendency on the nucleus area along with substrate softening, suggesting that MSCs were responding to substrate stiffness. To reduce the influence of “mechanical memory”, only naïve cells were induced to differentiate. Safranin O (SO) staining revealed that 1 kPa substrate favored cell agglomeration, typical of chondrogenesis. Using fluorescence of this dye, we established a semi-quantitative assay to evaluate chondrogenic differentiation of MSCs. This assay suggests that 1 kPa substrate potentiates chondrogenic differentiation of MSCs. Despite SO assay results need further validation by RT-PCR, preliminary data indicates 1 kPa as the optimal stiffness for chondrogenic differentiation.