Antibodies purification using centrifugal partition chromatography

Abstract

A dificuldade em desenvolver antibióticos mais eficientes, numa altura em que a resistência microbiana tem vindo a aumentar, torna essencial o desenvolvimento de terapias alternativas, económicas e eficazes. Os anticorpos obtidos a partir da gema de ovo de galinha, imunoglobulina Y (IgY), têm-se destacado não só pela sua produção mais simples e em maior quantidade em relação aos anticorpos policlonais de mamífero, mas também devido às inúmeras vantagens em termos de aplicações. No entanto, atualmente não existe uma plataforma de purificação de IgY que seja económica, eficaz e passível de aplicação a nível industrial - uma lacuna que este trabalho se propõe a resolver. Assim, neste trabalho, estudou-se a possibilidade da utilização de sistemas aquosos bifásicos (SAB) compostos por PEG 1000 e tampão fosfato (K2HPO4/KH2PO4) ou K2HPO4, seguidos de um passo de ultrafiltração, ou acoplados à tecnologia de cromatografia de partição de força centrífuga (CPC), para a purificação de IgY. Foram avaliados os efeitos de pH (5,5; 6,0; 6,5; 7,5; e 8,0) e composição de PEG e sal na extração de IgY, bem como as condições utilizadas na CPC (fluxo da fase móvel, rotação e modo de operação). Foi estudada a estabilidade do anticorpo em soluções aquosas dos componentes utilizados nos SAB utilizando dicroísmo circular, assim como a atividade/estabilidade do anticorpo após o processo de purificação por ELISA, salientando assim o efeito do PEG 1000 na estrutura secundária e na atividade do IgY. O ATPS constituído por 18 % PEG 1000 + 13 % tampão fosfato a pH 6,0 conduz aos melhores resultados em termos de purificação, obtendo-se num único passo de extração uma pureza de IgY de 39 %. Após a aplicação de CPR, obteve-se IgY com um grau de pureza de 51 %, e com ultrafiltração, IgY com um grau de pureza de 47 %. Face aos resultados obtidos, destaca-se a CPR como a técnica mais adequada dado que permite obter IgY com um maior grau de pureza e ser passível de aplicação à escala industrial.

The difficulty in developing more effective antibiotics, at a time where the microorganism’s resistance to them has been increasing, turns essential the development of cheaper and effective alternative therapeutics. Antibodies obtained from the chicken’s egg yolk, immunoglobulin Y (IgY), have stood out because of their production simplicity and production in higher quantity when compared to mammal polyclonal antibodies, and also because of their advantages in terms of applicability. Nonetheless, there is still no low-cost, effective and scalable platform for the IgY purification - a vacuity that this work aims to solve. Therefore, in this work, the possibility of using aqueous biphasic systems (ABS) composed of PEG 1000 and phosphate buffer (K2HPO4/KH2PO4) or K2HPO4, followed by an ultrafiltration step, or coupled with centrifugal partition chromatography (CPC), was studied. The effect of pH (5.5; 6.0; 6.5; 7.5 and 8.0) and the PEG + phosphate buffer composition in the extraction of IgY was investigated, as well as the conditions to be used in CPC (mobile phase flow rate, rotation, and the operation mode). The stability of the antibody in aqueous solutions of the components used in the ABS formation was studied using circular dichroism, as well as the activity/stability of the antibody after the purification process, by ELISA, primarily outlining the effect of PEG 1000 in the secondary structure and activity of IgY. The ABS composed of 18 wt % PEG 1000 + 13 wt % phosphate buffer at pH 6.0 yielded the best results in terms of purification, achieving a 39 % IgY purity in a single extraction process. After the application of CPC, an IgY purity of 51 % was obtained, and with the ultrafiltration technique a purity of 47 % was obtained. According to these results, CPC appears as the most adequate purification technique due to the higher purity of IgY obtained and possibility of being applied at an industrial level.