Assessing the impact of silver nanoparticles on cell metabolism: an in vitro NMR metabolomics study

Abstract

Face ao uso disseminado e enorme potencial terapêutico das nanopartículas de prata (AgNPs), o estudo dos seus efeitos biológicos é um assunto relevante e atual. O trabalho apresentado nesta tese teve como objetivo aprofundar o conhecimento existente sobre o impacto das AgNPs no metabolismo celular, usando a metabolómica por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Os tipos celulares escolhidos para este estudo foram queratinócitos da epiderme humana, células de hepatoma humano e macrófagos sanguíneos, por serem relevantes, respetivamente, ao nível da entrada, acumulação e captação de nanopartículas no organismo. O Capítulo 1 introduz as principais propriedades das AgNPs, a sua atividade biológica e potencial toxicidade, e descreve a abordagem metabolómica, incluindo uma breve revisão bibliográfica das suas aplicações em nanotoxicologia. O âmbito e os objetivos desta tese são, também, apresentados. O Capítulo 2 descreve os métodos experimentais utilizados ao longo deste trabalho, incluindo a caracterização das AgNPs, os procedimentos usados na cultura celular e nos ensaios biológicos, a colheita e preparação de amostras, a análise por RMN e o tratamento estatístico dos dados. No Capítulo 3, a atividade metabólica e a composição dos três tipos de células usados neste trabalho (queratinócitos HaCaT, células de hepatoma HepG2 e macrófagos RAW 264.7) são descritas com base na análise por RMN dos sobrenadantes dos meios de cultura (exometaboloma) e dos extratos celulares polares e lipofílicos (endometaboloma). O Capítulo 4 apresenta a análise metabolómica das células HaCaT expostas a AgNPs de diferentes tamanhos (10, 30 ou 60 nm de diâmetro) e revestimentos (citrato, polietilenoglicol ou albumina de soro bovino). Verificou-se que o metaboloma celular foi afetado mesmo a concentrações subtóxicas de AgNPs, sugerindo: aumento da glicólise e glutaminólise, alteração na atividade do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) e nos processos de produção e transferência de energia, degradação de proteínas, síntese de glutationa (GSH), modificações a nível das membranas e do equilíbrio osmótico. Apesar de muitas variações serem comuns a todas as nanopartículas testadas, as AgNPs de 10 nm causaram os efeitos mais distintos, nomeadamente no que diz respeito à glicólise e à síntese/utilização de GSH. Além disso, a exposição celular a prata iónica (Ag+) confirmou o importante papel dos iões prata no mecanismo de ação das AgNPs, enquanto a comparação com o peróxido de hidrogénio (H2O2) permitiu destacar os efeitos relacionados com o stress oxidativo. No Capítulo 5 são apresentadas as respostas metabólicas das células de fígado HepG2 a dois tipos de AgNPs, umas obtidas por redução química e estabilizadas em citrato e as outras obtidas por síntese verde na presença de um extrato vegetal (Cit30 e GS30, respetivamente), ambas com centros metálicos de 30 nm. Os resultados sugeriram adaptações metabólicas em processos de produção de energia (metabolismo da glucose e sistema da fosfocreatina), autofagia e metabolismo lipídico, refletindo possivelmente a ativação de mecanismos de proteção. Ainda que os dois tipos de AgNPs tenham induzido muitos efeitos semelhantes, as Cit30 pareceram causar um maior impacto no ciclo TCA e na degradação de proteínas, enquanto as GS30 aparentaram induzir uma diminuição mais forte na síntese de fosfolípidos. A assinatura metabólica da prata iónica foi bastante semelhante à das AgNPs, sugerindo, no entanto, uma menor capacidade das células expostas a Ag+ extracelular para lidar com o stress oxidativo. O Capítulo 6 descreve a avaliação do impacto das AgNPs Cit30 no metaboloma de macrófagos de murganho RAW 264.7, a concentrações subtóxicas (decréscimos de ~5 e 20% na viabilidade celular). As alterações encontradas apontaram para: estimulação da glicólise (a baixa concentração de exposição), reprogramação do ciclo TCA (resultando numa intensa produção de itaconato e succinato e numa marcada depleção de ATP, consistentes com uma resposta pro-inflamatória), ativação da gluconeogénese, promoção da síntese de GSH e acumulação de creatina/fosfocreatina. Foram, ainda, observadas variações possivelmente relacionadas com a osmorregulação e a modificação membranar. De notar que os macrófagos expostos a Ag+ mostraram características semelhantes aos expostos a AgNPs (por ex., aumento da glucose intracelular – gluconeogénese), mas também revelaram efeitos distintos, nomeadamente em metabolitos envolvidos no ciclo TCA, em processos de transferência de energia e no metabolismo lipídico. Adicionalmente, viu-se que o metaboloma dos macrófagos respondeu de maneira diferente à exposição a H2O2 (por ex., tendência para diminuição da glicólise e sem efeitos observados na ativação da gluconeogénese ou da síntese de GSH), indicando que muitos dos efeitos induzidos pelas AgNPs não foram necessariamente mediados por stress oxidativo. Finalmente, com base na integração dos resultados apresentados ao longo dos capítulos anteriores, as principais conclusões deste trabalho são apresentadas e discutidas no Capítulo 7.

The wide dissemination and promising therapeutic potential of silver nanoparticles (AgNPs) make the study of their biological effects a relevant upto- date subject. The work presented in this thesis aimed at deepening current understanding of the impact of AgNPs on cell metabolism, using NMR metabolomics of cultured mammalian cells. Epidermis keratinocytes, hepatoma cells and blood macrophages, relevant, respectively, to nanoparticle entry, accumulation and uptake, have been selected for the study. Chapter 1 introduces the main properties of AgNPs, including their biological activity and toxicological potential, and describes the metabolomics approach, briefly reviewing its applications in the field of nanotoxicology. Also, the scope and aims of this thesis are presented. Chapter 2 covers the experimental methods adopted during the course of this work, including the sources and characterisation of AgNPs, the procedures used in cell culture and biological assays, sample collection and preparation methods, NMR analyses and statistical data treatment. In Chapter 3, the metabolic activity and composition of the three cell types used in this work (HaCaT keratinocytes, HepG2 hepatoma cells and RAW 264.7 macrophages) are described based on the NMR analysis of culture medium supernatants (exometabolome) and polar/lipophilic cell extracts (endometabolome). Chapter 4 presents the metabolomic analysis of HaCaT skin cells exposed to AgNPs of different sizes (10, 30 or 60 nm in diameter) and coatings (citrate, polyethylene glycol or bovine serum albumin). The cellular metabolome was found to be affected even at sub-toxic concentrations of AgNPs, suggesting: upregulation of glycolysis and glutaminolysis, altered tricarboxylic acid (TCA) cycle activity, protein degradation, disruption of energy-producing pathways, glutathione (GSH) synthesis, membrane modification and changes in osmotic balance. Although several metabolic variations were common to all tested nanoparticles, the 10 nm AgNPs showed the most distinct effects, namely in regard to glycolysis and GSH synthesis/utilisation. Furthermore, cell exposure to ionic silver (Ag+) confirmed the major role of silver ions in AgNPs mode of action, while comparison with hydrogen peroxide (H2O2) allowed the effects related to oxidative stress to be highlighted. In Chapter 5, the metabolic responses of liver HepG2 cells to two types of 30 nm AgNPs, obtained by chemical reduction and stabilised with citrate or produced by green synthesis in the presence of a plant extract (Cit30 and GS30, respectively) are presented. Sub-toxic concentrations of AgNPs were proposed to induce metabolic adaptations in energy production processes (glucose metabolism and the phosphocreatine system), autophagy and lipid metabolism, possibly reflecting the activation of metabolism-mediated protective mechanisms. Although the two types of AgNPs induced many common effects, Cit30 appeared to have a greater impact on the TCA cycle and protein degradation, whereas GS30 seemed to induce stronger downregulation of phospholipid synthesis. The metabolic signature of Ag+ was largely similar to that of AgNPs, although suggesting a lower ability of cells exposed to extracellular Ag+ to cope with oxidative stress. Chapter 6 addresses the impact of Cit30 AgNPs on the metabolome of murine RAW 264.7 macrophages, at concentrations causing minimal (~5 and 20%) decreases in cell viability. Exposed cells were suggested to upregulate glycolysis (at the low exposure concentration), to reprogram the TCA cycle (resulting in marked production of itaconate and succinate and in ATP depletion, consistent with a pro-inflammatory response), to activate gluconeogenesis, to promote GSH synthesis, and to increase the creatine/phosphocreatine pool. Changes putatively related to osmoregulation and membrane modification were also observed. Notably, macrophages exposed to Ag+ showed common features to AgNPs-exposed cells (e.g. increased intracellular glucose suggesting gluconeogenesis), but also several distinct effects, for instance in metabolites involved in the TCA cycle, energy transfer processes or lipid metabolism. Furthermore, the cellular metabolome responded differently to H2O2 exposure (e.g. trend for downregulated glycolysis, no evidence of gluconeogenesis activation or of GSH upregulation), indicating that many of the AgNPs-induced effects were not necessarily mediated by oxidative stress. Finally, based on the integration of the results presented along the previous chapters, the main conclusions of this work are presented and discussed in Chapter 7.