Valorization of industrial residues through mixed microbial cultures eco-engineering

Abstract

Hoje em dia, há uma necessidade urgente de reinventar os processos industriais a partir dos quais a nossa sociedade subsiste, tornando-os mais sustentáveis. A União Europeia (UE) estabeleceu um conjunto de pacotes com medidas que abrangem todo o ciclo: desde a produção ao consumo e à gestão de resíduos, e quanto ao mercado de matérias-primas secundárias. Pretende-se, com isto, caminhar em direção a uma economia circular, dando um destino diferente a todos os resíduos gerados. Em Portugal, umas das maiores e principais atividades económicas diz respeito à indústria papeleira. Consequentemente, grandes quantidades de resíduos são geradas. Estes são aproveitados para a produção de energia ou químicos para betumes e colas. Contudo, outras vias de valorização devem ser exploradas. São dois os principais métodos usados para a produção de papel: Kraft ou Cozimento ao Sulfito Ácido. O último dá origem ao licor de cozimento ao sulfito ácido (LCSA), rico em lenhosulfonatos (LS), compostos fenólicos e derivados, açúcares, como xilose e glucose, e ácido acético. Apesar da fração significativa de compostos recalcitrantes e inibidores, o LCSA pode ser valorizado através de processos microbiológicos. Biopolímeros, como polihidroxialcanoatos (PHA), substratos microbianos, e building-blocks, como ácidos orgânicos de cadeia curta (AOCC), podem ser produzidos. Os PHA são um grupo promissor de polímeros degradáveis com potencial para substituir alguns dos termoplásticos mais comuns. Nos últimos anos, a investigação tem-se focado no desenvolvimento de alternativas à produção deste polímero, incluindo o uso culturas microbianas mistas (CCM) e de resíduos industriais como substrato. O uso de CCM faz com que não sejam precisas condições de esterilidade e permite o uso de equipamento mais barato. O ponto fulcral para a produção de PHA a partir de CCM é a seleção da cultura. Normalmente, esta é feita submetendo a cultura a períodos de alternância de disponibilidade de carbono, designada alimentação aeróbia dinâmica (AAD). Os AOCC são monoácidos alifáticos com uma vasta gama de aplicações na indústria alimentar, farmacêutica e química. Desempenham, também, um importante papel enquanto compostos intermediários em processos biológicos, como a produção de PHA. Neste trabalho, o processo de produção de PHA a dois e três passos, usando o LCSA, foi estudado. O processo a dois passos incluiu (1) o enriquecimento da CCM em microrganismos (MO) acumuladores de PHA, usando diretamente o LCSA, seguido de (2) maximização da produção, usando a cultura selecionada e o LCSA. No processo a três passos, um passo preliminar de acidificação foi introduzido antes da seleção, com vista à conver-são dos açúcares do LCSA em AOCC. Todos os passos, e respetivos impactos nos passos seguintes, foram estudados. Paralelamente, a caracterização da comunidade microbiana do passo de seleção foi realizada, de forma a afinar os parâmetros operacionais para melhorar a produção de PHA. O processo a dois passos levou à seleção de uma cultura com baixa capacidade acumulativa, apesar da estabilidade do reator. Para além disso, os longos períodos necessários à estabilização (250 dias) constituem um obstáculo à viabilidade do processo. Posteriormente, uma extensa caracterização microbiológica revelou uma população paralela incapaz de acumular PHA. Esta população pode ter subsistido graças à fração de açúcares, a qual uma CCM não consegue converter em PHA. Para reduzir o tempo de estabilização do reator de seleção e entender o efeito dos AOCC na seleção de MO acumuladores de PHA, o LCSA foi suplementado com ácidos sintéticos. Obteve-se, assim, uma cultura estável com apenas 25 dias de operação. Adicionalmente, a cultura selecionada conseguiu acumular um máximo de 47.1%, 7 vezes mais elevado do que aquele obtido nas condições anteriores. A comunidade microbiológica era dominada por Betaproteobacteria, nomeadamente, Acidovorax (71%). Uma vez provada a relação entre estabilidade do reator e a presença de ácidos, o passo seguinte focou-se na fermentação acidogénica do LCSA. Ao invés do uso de uma típica cultura anaeróbia, foi possível selecionar MO acidogenos, capazes de converter os açúcares em AOCC, a partir de uma cultura aeróbia. O processo decorreu num reator contínuo de mistura perfeita (RCMP) sem controlo de pH. Obteve-se, desta forma, um máximo de 7.45 gCOD L-1 de ácidos, correspondendo a um grau de acidificação de 38.0%. Na produção de AOCC, a influência do pH e da conformação do reator foi analisada. Controlando o pH a 6, 7 e 8 num RCMP obteve-se perfis variados de ácidos com uma concentração de 2.36, 2.38 e 2.27 gCOD L-1, respetivamente. Alterando a conformação do reator para reator contínuo de leito fixo, obteve-se um perfil de ácidos dominado pelo ácido butírico. Caracterizou-se, igualmente, por uma maior estabilidade do que o RCMP sem controlo de pH. Por fim, o processo a três passos foi estudado. O efluente recolhido dos reatores de acidogénese foi usado para selecionar uma CCM. Uma vez mais, não demorou mais que 25 dias a alcançar uma fase estável de cada vez que os parâmetros operacionais eram manipulados (tempo de retenção hidráulico, carga orgânica e/ou duração do ciclo). Uma cultura robusta foi obtida com uma boa capacidade acumulativa de PHA usando diferentes resíduos. Um máximo de 74.4% de PHA foi alcançado sob limitação por azoto. Diferentes copolímeros e homopolímero foram produzidos através do uso de diferentes resíduos.

Nowadays, there is an urgent need to reinvent the industrial processes in which our society relies, making them more sustainable. The European Union (EU) established a set of packages with measures covering the whole cycle: from production and consumption to waste management and the market for secondary raw materials. It is intended to move from a “cradle-to-grave” tendency, and start to give a different destination to all residues and wastes generated. In Portugal, one of the main and biggest activities is the pulp and paper industry. Consequently, large quantities of residues are generated and are usually burnt for energy or chemicals recovery and for concretes additives and adhesives, but other ways to valorize them are needed. Two main process are used for pulp making: kraft and acidic aulfite pulping. The latter originates hardwood sulfite spent liquor (HSSL) which is characterized for having significant amounts of lignosulphonates (LS), phenolic extractives compounds and derivatives, sugars such as xylose and glucose and acetic acid. Despite its considerable fraction of recalcitrant and inhibitory components, HSSL can be valorized through microbial conversion. Biopolymers such polyhydroxyalkanoates (PHA) and microbial substrates and building blocks like short-chain organic acids (SCOA) can be produced. PHA are a promising group of eco-efficient biodegradable polymers with potential to replace some of the most commonly used thermoplastics. In recent years, research focused on the development of alternative PHA production processes, including the use waste/surplus based feedstocks and mixed microbial cultures (MMC). MMC do not require sterilization and expensive equipment, thereby reducing costs. The key point of PHA production by MMC is culture selection, which is generally carried out by subjecting cultures to alternate periods of carbon availability, designated as aerobic dynamic feeding (ADF). SCOA are aliphatic monocarboxylic acids, with a vast number of applications in food and beverages industry, pharmaceutical and chemical fabrication fields. Also, they have an important role as intermediates in many biological processes, such PHA production. In this thesis, two and three-stage PHA production processes from HSSL were studied. The two-stage process included (1) the enrichment of an MMC in PHA-storing microorganisms (MO) direct from HSSL, followed by (2) maximization of PHA production using the selected culture and the HSSL. In the three-stage, a preliminary step of acidification, where the sugars fraction is converted into SCOA was introduced before the selection step. All stages were studied and the respective impact of each stage on subsequent ones was also assessed. In addition, microbial community characterization of the selection stage was done to tune operational parameters towards the improvement of PHA accumulation. The two-step process led to a culture with low PHA storage performance, despite the stability of the selection reactor. Furthermore, the long stabilization time of the process (250 days) required could be a significant obstacle to the viability of the process. Later, an extensive microbial characterization revealed a side population that might be responsible to hinder the selection step stopping the dominance of PHA-storing MO. Such fact, could be due to the sugars fraction that MMC are not able to convert into PHA. To decrease the stabilization time and understand the effect of SCOA in the PHA-storing MO selection, HSSL was supplemented with synthetic SCOA. A stable MMC was reached after only 25 days. Additionally, the selected MMC reached a maximum PHA content of 47.1%, which was 7 times higher than in the previous condition. The selection step led a community dominated by Betaproteobacteria, namely Acidovorax (71%). Once proved that the single addition of SCOA led to stable cultures, the next step focused on the acidogenic fermentation of HSSL. Instead of using a typical anaerobic culture, from an aerobic MMC inoculum was possible to successfully select acidogenic microorganisms able convert sugars into SCOA without pH control in a continuous stirring tank reactor (CSTR). The maximum concentration of SCOA produced was 7.45 gCOD L-1, corresponding to a degree of acidification 38.0%. In SCOA production, pH and reactor conformation influence was also assessed. Controlling pH at 6, 7 and 8 in the CSTR resulted in diverse SCOA profiles with average productions of 2.36, 2.38 and 2.27 gCOD L-1, respectively. Changing the reactor conformation from CSTR to moving bed biofilm reactor (MBBR) led to a profile dominated by butyric instead of acetic acid, with a more stable production than the CSTR without pH control. Finally, the three-stage process was applied. The effluent collected from the acidogenic fermentation was used to enrich an MMC. It took no longer than 25 days to reach a stable phase every time an operational parameter (HRT, OLR and/or cycle length) was changed. A robust culture was obtained, that despite being selected with only one of the previous effluents, it could accumulate PHA when different streams from the pulp industry were fed. A maximum of PHA accumulation of 74.4% was reached, under ammonium limitation. Moreover, different copolymers and homopolymer were obtained through the feeding of the different streams.