Analytical strategies based on mass spectrometry toward identifying nitro oxidative modifications in phospholipids

Abstract

Os lípidos são considerados alvos importantes das espécies reativas de nitrogénio (RNS, do inglês Reactive Nitrogen Species), formadas em condições de stresse nitroxidativo. As RNS podem levar à formação de uma grande variedade de lípidos modificados, formados através de reações de nitração, nitrosação e nitroxidação. Os ácidos gordos nitrados (NO2-FA) têm sido descritos como os principais produtos endógenos formados pela reação entre ácidos gordos e RNS, e já foram detetados em plasma, urina e tecidos. Os NO2-FA são considerados compostos bioativos com um importante papel como agentes anti-inflamatórios, anti-hipertensivos e anti-trombóticos, estando envolvidos na modulação de complicações metabólicas e inflamatórias. Apesar da relevância da nitração de lípidos, maioritariamente descrita para os NO2-FA, a nitração de fosfolípidos, que são os principais constituintes das membranas celulares, permanece um campo de investigação pouco explorado continuando a existir uma falha de conhecimento no que diz respeito ao tipo de produtos fosfolipídicos que podem ser formados em condições de stresse nitroxidativo, e quais os seus papéis nos sistemas biológicos. Para ultrapassar esta questão, os principais objetivos desta tese de doutoramento consistiram no desenvolvimento de abordagens baseadas em espectrometria de massa (MS) para a) a identificação de diferentes fosfolípidos nitrados e nitroxidados, b) a identificação dos padrões de fragmentação característicos dos fosfolípidos modificados, c) aplicar as estratégias desenvolvidas e baseadas em espectrometria de massa para detetar fosfolípidos nitrados e nitroxidados in vivo em modelos de doença, d) avaliar o papel dos fosfolípidos nitrados e nitroxidados como agentes anti-inflamatórios e antioxidantes e e) avaliar a sua interação com proteínas. De um modo geral, pretendemos contribuir para o conhecimento das modificações químicas em fosfolípidos induzidas em condições de stresse nitroxidativo e a significância biológica desses produtos. Para alcançarmos os objetivos propostos, os derivados nitrados dos fosfolípidos (NO2-PL), nomeadamente os derivados nitro de fosfatidilcolinas (NO2-PC), fosfatidiletanolaminas (NO2-PE) e fosfatidilserinas (NO2-PS), contendo diferentes ácidos gordos, foram estudados por MS. Os NO2-PL foram sintetizados utilizando nitrónio tetraflouroborato (NO2BF4), mimetizando condições de stresse nitroxidativo, e foram posteriormente identificados por MS com ionização por electrospray (ESI-MS) e caracterizados por espectrometria de massa tandem (ESI-MS/MS). O seu padrão de fragmentação típico foi identificado e incluí a perda do grupo nitro (HNO2) e a formação de ácidos gordos nitrados. Esta metodologia baseada em MS, permitiu a deteção de oito derivados nitrados de fosfolípidos, sete NO2-PCs e uma NO2-PE, em mitocôndrias isolados do coração de um modelo animal de diabetes mellitus tipo 1 obtido pela administração de streptozotocina (STZ). Estas descobertas irão contribuir para a compreensão dos mecanismos de nitração em ambientes biológicos e para estabelecer a relevância fisiológica dos NO2-PLs. Além disso, outros derivados nitrados e nitroxidados das PCs e PEs com diferentes combinações de ácidos gordos foram também sintetizados utilizando o modelo biomimético de nitroxidação e, posteriormente, foram estudados por cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa e MS/MS. Os derivados modificados de fosfolípidos incluíram: derivados nitroso e dinitroso, nitro e dinitro, e nitronitroso, em conjunto com derivados nitroxidados. A fragmentação típica para cada uma estas modificações foram a perda de HNO e HNO2, as perdas combinadas de HNO (HNO2) e a cabeça polar dos fosfolípidos, e ainda iões produto correspondentes às cadeias de ácido gordo modificadas, nomeadamente iões [NOn-FA+On+H]+ e [NOn-FA+On-H]- (n=1-2). Estas fragmentações permitiram identificar PCs nitradas, incluindo NO2-PC, (NO2)2-PCs, (NO2)(NO)-PC, NO-PC; PEs nitradas, NO2-PEs; e uma PC nitroxidada (NO2)(2O)-PC em cardiomioblastos H9c2 em condições de starvation, mas não foram detetadas em células em condições de isquémia nem no controlo. A relevância fisiológica das PCs e PEs nitradas e nitroxidadas observadas exclusivamente em cardiomioblastos H9c2 em condições de starvation permanece desconhecida mas estas espécies podem ter um papel na cardioproteção que merece ser explorada. Para avaliar os possíveis efeitos biológicos dos NO2-PL, os produtos nitrados/nitroxidados da POPC, nomeadamente os derivados NO2-POPC, foram incubados com macrófagos Raw 264.7, uma linha celular de monócitos de ratinho estimulada com LPS, demonstrando ter propriedades anti-inflamatórias pela diminuição da expressão da forma induzível da óxido nítrico sintase (iNOS). Os produtos nitrados/nitroxidados da POPC demonstraram ainda ter propriedades antioxidantes, nomeadamente como scavengers, demonstrada pela capacidade de reduzir os radicais ABTS●+, DPPH● e peroxílo (ensaio ORAC). Tendo em conta que os efeitos biológicos dos lípidos nitrados ocorre via modificações pós-transducionais de proteínas, também avaliámos a capacidade dos produtos nitrados/nitroxidados da POPC em interagir com proteínas, especificamente a adição dos derivados NO2-POPC, principais produtos formados durante a nitração biomimética da POPC, com a vimentina que é um filamento intermediário. Para avaliar o efeito da NO2-POPC foram utilizados ensaios de competição in vitro, onde as suas interações foram avaliadas utilizando western blotting. A interação dos produtos nitrados/nitroxidados da POPC com a vimentina protegeu-a da modificação pela iodoacetamida biotinilada. Os produtos nitrados/nitroxidados da POPC também induziram alterações na organização da rede de vimentina. Estes efeitos foram avaliados, utilizando microscopia confocal, em células de carcinoma adrenal SW13, as quais expressam construções específicas de vimentina. Os resultados obtidos com esta tese de doutoramento fornecem novas informações baseadas em abordagens avançadas de MS para a identificação de modificações em PLs induzidas pelas RNS nomeadamente em condições de stresse nitroxidativo, o que irá ser crucial para a sua identificação em amostras biológicas, e ainda para o desvendar dos seus potenciais papéis a nível biológico.

Lipids are considered important targets of reactive nitrogen species (RNS), under nitroxidative stress conditions. Various RNS can lead to a great variety of modified lipids, formed via nitration, nitrosation and nitroxidation reactions. Nitro-fatty acids (NO2-FA) have been reported as major endogenous products formed between fatty acids (FA) and RNS, and have been detected in plasma, urine, and tissues. NO2-FA are considered important bioactive molecules with roles as anti-inflammatory, anti-hypertensive, and anti-thrombotic agents being involved in modulation of metabolic and inflammatory complications. In spite of the relevance of lipid nitration, it has been mainly focused on NO2-FAs, but in contrast, putative nitration of phospholipids (PL), the major constituents of cell membranes, remains an unexplored field of research. There are no studies regarding the type of PL products that can be formed under nitroxidative stress conditions and their possible roles in biological systems. To overcome this issue, the main goals of this PhD were the development of mass spectrometry (MS)-based approaches a) to identify different PL nitrated and nitroxidized products, b) to identify the characteristic fragmentation pattern of modified PL, c) to apply the developed MS-based strategies to detected nitrated and nitroxidized PL species in in vivo models of disease, d) to evaluate the role of nitrated and nitroxidized PLs as anti-inflammatory and as antioxidants, and c) to evaluate their adduction to proteins. Overall it is expected to contribute for the understanding of the chemical modifications induced by nitroxidative stress to PLs and their biological significance. To accomplish our goal, first we analyzed nitrated PL species (NO2-PL), namely nitro derivatives of phosphatidylcholine (NO2-PC), phosphatidylethanolamine (NO2-PE) and phosphatidylserine (NO2-PS), bearing different FA by MS. NO2-PL were synthesized using nitronium tetrafluoroborate (NO2BF4) in a biomimetic system of nitroxidative stress conditions. NO2PL were identified by electrospray (ESI)-MS and characterized by ESI tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). The typical fragmentation pattern of NO2-PL was determined and included the loss of nitro group (HNO2) and the formation of nitrated fatty acids. The MS reported ions allowed us to detect eight nitrated derivatives of PLs, seven NO2-PCs and one NO2-PE, in cardiac mitochondria isolated from heart of a well-characterized animal model of type 1 diabetes mellitus (T1DM) obtained by administration of streptozotocin (STZ). These findings will contribute for the understanding of nitration in biological environments, and to establish the physiological relevance of NO2-PL species. In addition, different nitrated and nitroxidized derivatives of PCs and PEs with different combinations of FA were also generated using the biomimetic model of nitroxidation and were studied by liquid chromatography (LC)-MS and MS/MS approaches. Single and multiple nitrated derivatives of PLs such as nitroso and dinitroso, nitro and dinitro, nitronitroso derivatives, together with nitroxidized derivatives were identified and their specific fragmentation pathways were assigned. Typical reporter product ions of these modifications were loss of HNO and HNO2, the combined loss of HNO (or HNO2) and polar head groups, and [NOn-FA+On+H]+ and [NOn-FA+On-H]- (n=1-2) product ions corresponding to the modified fatty acyl chains, depending on each modification. These reported fragmentations allowed the identification of nitrated PCs, including NO2-PC, (NO2)2-PCs, (NO2)(NO)-PC, NO-PC; nitrated PEs, NO2-PEs; and nitroxidized PCs, (NO2)(2O)-PC in cardiomyoblast H9c2 cells under starvation conditions, but not in cells under ischemia neither in control. The physiological relevance of nitrated and nitroxidized PCs and PEs species observed exclusively in cardiomyoblast cells (H9c2) under starvation is still unknown but could have a role in cardioprotection that deserves to be explored. To evaluate the putative biological effects of NO2-PL, nitrated/nitroxidized products of POPC, namely the NO2-POPC derivatives, were incubated with Raw 264.7 macrophages, a mouse leukaemic monocyte cell line, stimulated with LPS, and revealing anti-inflammatory properties by decreasing the expression of the inducible nitric oxide synthase (iNOS). Nitrated/nitroxidized products of POPC also showed antioxidant properties, namely as scavenging agents, demonstrated by reducing the ABTS●+, DPPH● and peroxyl radicals (ORAC assay). Considering that the biological effects of nitrated lipid occur via post-translational modification (PTM) of proteins, we had also evaluated the ability of nitrated/nitroxidized products of POPC to interact with proteins. For that it was studied the adduction of NO2-POPC derivatives, the major product formed during biomimetic nitration of POPC, with vimentin, an intermediate filament protein, assessed using in vitro gel-based competition assay, and their interactions were evaluated using western blotting. The interaction of nitrated/nitroxidized products of POPC with vimentin shielded its modifications by biotinylated iodoacetamide. The effects of nitrated/nitroxidized products of POPC in the organization of vimentin network was also evaluated in SW13 adrenal carcinoma cell line expressing defined vimentin constructs using confocal microscopy. The results gathered in his study revealed that nitrated/nitroxidized products of POPC can interact with vimentin and induced changes in the organization of vimentin network. Overall, the results gathered in this PhD thesis provide new tool based on advanced MS approaches to identify structural modification of phospholipids induced by RNS namely under nitroxidative stress, that can be successfully used to pinpoint these nitrated species in different systems, and will be crucial for their identification in biological samples, and to unveil some of their potential roles in biological systems.