Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/22402
Title: Characterization of carbohydrates from Nannochloropsis oculata and their use in microarrays
Other Titles: Caracterização dos hidratos de carbono de Nannochloropsis oculata e sua utilização em microarrays
Author: Pandeirada, Carolina Oliveira
Advisor: Coimbra, Manuel António
Nunes, Cláudia Sofia Cordeiro
Keywords: Bioquímica alimentar
Polissacarídeos
Hidratos de carbono
Proteínas imobilizadas
Defense Date: 31-Jul-2017
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Marine microalgae are of easy culturing and able to accumulate compounds, such as polysaccharides (PS) and glycolipids (GL), which have been attributed biological activities. The present work aimed to study the structural features of the PS and the carbohydrates of the GL of the marine microalga Nannochloropsis oculata using carbohydrate analyses and microarrays. Biomass was defatted, extracted with hot-water (HW), and ultrafiltered. This yielded a residue rich in (1→4)-Glc that was assigned to the presence of a cellulose cell-wall, one filtrate rich in mannitol, and one rentante (Mw>10 kDa) that comprised the soluble PS. The soluble PS were fractionated through ethanol precipitation giving three fractions, Et50, Et85 and EtSN. The PS in Et85 were further fractionated through an anion-exchange chromatography, yielding fractions #1, #2, and #3. All PS fractions comprised uronic acids and sulfate groups, being this content almost negligible in fraction #1. Carbohydrate analyses together with microarrays experiments using proteins with known carbohydrate-binding specificities allowed to verify that the PS in Et50 are dominated by (β1→4)-Glc and exhibited also domains of (β1→3, β1→4)-glucans. PS in Et85 and EtSN fractions were composed by Rha and Man, comprising other sugars in lower content, Xyl, Fuc, and Gal. Fractions Et85, #1, #2, #3, and EtSN comprised mainly (1→2)-Rha with a branching point occurring at position C-3. Fractions Et85, #2, and #3 included also the substituted residue 2,3,4-Rha. In fraction Et85, the sulfate group occurred at position C-3, and simultaneously at positions C-3 and C-4 of (1→2)-Rha. Fractions #2 and #3, besides Rha residues, contained Xyl, Fuc, and Gal, suggesting that these are part of anionic sulfated heteropolysaccharides. The Man, in Et85 and EtSN, occurred mainly as (1→3)- and (1→4)-Man residues, being these part of non-anionic PS in fraction Et85. Carbohydrate microarrays highlighted that Man may be present in α-configuration due to the interaction with ConA. The protein BT0996 of the Bacteroides thetaiotaomicron, a human gut bacteria, used in microarrays, displayed that the PS in fractions Et50, Et85, #1, and #3 may share a common epitope. This interaction is remarkable as it shows that these PS are probably metabolized in the human gut. The GL occur mainly as mono- and digalactolipids, being the presence of galactolipids confirmed through microarrays by interaction with RCA120. Carbohydrate analyses highlighted that the lipid fraction may comprise sulfoquinovosyl diacylglycerol. Considering the results obtained, the joint use of carbohydrate analyses with microarrays showed to be a suitable approach to identify the structural features of the PS and the GL of the marine microalga N. oculata.
As microalgas marinhas são fáceis de cultivar e acumulam compostos, como polissacarídeos (PS) e glicolípidos (GL), aos quais têm sido atribuídas atividades biológicas. O presente trabalho teve como objetivo estudar as características estruturais dos PS e dos hidratos de carbono dos GL da microalga marinha Nannochloropsis oculata. A biomassa foi desengordurada, extraída com água quente (HW) e ultrafiltrada. Isto originou um resíduo rico em (1→4)-Glc, atribuído à presença de celulose na parede celular, um filtrado rico em manitol e um retentato (Mw>10 kDa) que continha os PS solúveis. Os PS solúveis foram fracionados por precipitação em etanol originando três frações, Et50, Et85 e EtSN. Os PS da fração Et85 foram sujeitos a fraccionamento por cromatografia de troca aniónica, obtendo-se as frações #1, #2 e #3. Todas as frações contiveram ácidos urónicos e grupos sulfato, sendo este conteúdo quase negligenciável na fração #1. As análises de açúcares, juntamente com os microarrays usando proteínas de especificidades conhecidas, permitiram verificar que os PS da fração Et50 são constituídos por (β1→4)-Glc, exibindo também domínios de (β1→3, β1→4)-glucanas. Os PS das frações Et85 e EtSN incluíram maioritariamente Rha e Man, contendo também outros açúcares em menores quantidades, Xyl, Fuc e Gal. As frações Et85, #1, #2 e #3, e EtSN possuiram principalmente (1→2)-Rha, com uma ramificação na posição C-3. As frações Et85, #2 e #3 continham também o resíduo substituído 2,3,4-Rha. Na fração Et85 os grupos sulfato encontraram-se na posição C-3, e simultaneamente nas posições C-3 e C-4 de (1→2)-Rha. As frações #2 e #3, além de resíduos de Rha continham Xyl, Fuc e Gal, sugerindo que estes fazem parte de heteropolissacarídeos aniónicos sulfatados. A Man, nas frações Et85 e EtSN, encontrou-se maioritariamente como (1→3)- e (1→4)-Man, fazendo parte de PS não-aniónicos na fração Et85. A análise por microarrays evidenciou que a Man deve encontrar-se em configuração α devido à interação com a ConA. A proteína BT0996 da bactéria Bacteroides thetaiotaomicron, do sistema digestivo humano, usada nos microarrays, mostrou que os PS nas frações Et50, Et85, #1 e #3 podem conter um epítopo comum. Esta interação evidencia que os PS de N. oculata poderão ser metabolizados no sistema digestivo humano. Os GL de N. oculata ocorrem principalmente como mono- e digalactolipídos, sendo a sua presença confirmada pelos microarrays por interação com a proteína RCA120. A análise de açúcares evidenciou também que a fração lipídica deve conter sulfoquinovosil diacilglicerol. Considerando os resultados obtidos, a combinação das análises de açúcares com os microarrays mostraram ser uma abordagem adequada para identificar as características estruturais dos PS e GL da microalga N. oculata.
Description: Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Alimentar
URI: http://hdl.handle.net/10773/22402
Appears in Collections:UA - Dissertações de mestrado
DQ - Dissertações de mestrado

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