Uma abordagem epigenética à determinação da idade de amostras biológicas: potenciais aplicações forenses

Abstract

Ao longo do tempo de vida, um processo estocástico influenciado pela hereditariedade, fatores ambientais, estilo de vida e doenças conduz a alterações graduais de biomoléculas ao nível molecular e celular – o envelhecimento. Estas alterações podem auxiliar em investigações forenses na determinação da idade de indivíduos e, respetiva identificação, por métodos morfológicos, bioquímicos e moleculares. Contudo, estes marcadores biológicos possuem baixa precisão na estimativa da idade e inúmeras limitações práticas. Uma das modificações epigenéticas que está amplamente correlacionada com a idade é a metilação do ADN, uma vez que os níveis de metilação globais diminuem ao longo do envelhecimento. Desta forma, foram analisados os padrões de metilação de promotores de genes, no sentido de criar um modelo robusto de previsão da idade. Neste estudo, avaliamos a introdução de uma nova abordagem na análise do estado de metilação de três loci (EDARADD, NPTX2 e TOM1L1) – a High-Resolution melting. Inicialmente, foi realizada uma otimização desta metodologia, pela avaliação dos métodos de extração do ADN e dos kits de conversão testados. Estas etapas revelaram ser fatores-chave para a correta análise dos padrões de metilação por HRM num conjunto de amostras estudadas. Esta metodologia permitiu diferenciar as amostras, segundo o estado de metilação dos referidos marcadores, em grupos etários, revelando alguma imprecisão desta técnica para a estimativa da idade. Por último, foi avaliada a metilação global de ADN genómico de uma pequena amostragem, na qual se comprovou a sua diminuição durante o processo de envelhecimento.

Throughout the lifetime, a stochastic process influenced by heredity, environment, lifestyle and disease leads to gradual alterations of biomolecules at molecular and cellular levels – aging. These changes can aid in forensic investigations to estimate the age of individuals and their identification by morphological, biochemical and molecular methods. However, all of these biomarkers have low precision and practical limitations. One of these epigenetic modifications has been correlated with age is DNA methylation, which global level of methylation decreases as a person ages. Therefore, several studies have analyzed the methylation patterns of gene promoters to create a robust model for predicting age. In this study, we evaluated new approach to the analysis of methylation status of three loci (EDARADD, NPTX2 and TOM1L1) – High-Resolution Melting. Firstly, we performed an optimization of this methodology by evaluation of DNA extraction methods and conversion kits. These steps have proven to be key factors for the proper analysis of methylation patterns in a set of samples by HRM. According to methylation status of three markers, this methodology allowed the differentiation of samples in age groups, revealing some technical inaccuracy to estimate age. Lastly, we evaluated the overall methylation of genomic DNA in a sampling and we testified its decrease during the aging process.