Origin of honey oligosaccharides: from model solutions to hive conditions

Abstract

Honey is essentially composed by carbohydrates, fructose (38 %) and glucose (31 %), mainly resultant of invertase activity. Furthermore, several oligosaccharides can be identified in honey, comprising 5 to 10 % of total carbohydrates. The origin of these oligosaccharides is still uncertain, as most of them are not present neither in nectar or in pollen. The research on this subject, mainly conducted in the past century, demonstrated the capability of invertase, namely the α-glucosidase activity, to transfer α-glucosyl residues to other carbohydrate moieties. As this transglucosylation activity was reported both to bees’ and honey’s invertases, it was proposed that the action of invertase was the source for α-glucose linked sugars. Nonetheless, there is still no explanation for the origin of the remaining oligosaccharides. The present work hypothesizes that nonenzymatic reactions could also occur in honey promoting the formation of oligosaccharides. This can be supported by the fact that honey maturation conditions, such as high sugar concentrations in acidic media, induce condensation of carbohydrates, reactions also known as reversion reactions. In order to validate this hypothesis, six aqueous model solutions (moisture content of 20 %) containing sucrose plus glucose, and sucrose plus fructose were prepared using diluted citric acid at pH 4.0, pH 2.0, and with no acid addition. The model solutions were kept in an oven at 35 ⁰C, which is the normal temperature inside beehives with brood production. Besides the influence of honey maturation conditions on its oligosaccharides profile was assessed by analysis of honeys with different properties, particularly the duration and season of maturation. Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) analysis allowed monitoring the changes occurring in each model solution along 5 months. This method revealed the occurrence of non-enzymatic oligosaccharide synthesis with a degree of polymerization (DP) up to 6 after 5 months. Ligand-exchange/size-exclusion chromatography (LEX-SEC) separation of the oligosaccharides formed in model solutions and present in honey and methylation analysis allowed to observe that the produced oligosaccharides had a glycosidic linkage composition similar to that obtained for honey oligosaccharides. In higher amounts, for most fractions, were terminally-linked glucose (Glc) residues together with lower amounts of (1->2)-, (1->4)- and (1->6)-Glc. Concerning fructose, terminally-linked fructose (Fru) residues were the most abundant and (2->1)- and (2->6)-Fru were in minor amounts. In addition, several branched residues were identified, being (1->2,3,4,6)-Glc the most abundant, and found predominantly in solutions prepared with citric acid. The structure and identity of the oligosaccharides were further elucidated by gas-chromatography coupled to mass-spectrometry (GC-MS) after derivatization to the alditol acetates derivatives.

O mel é composto essencialmente por hidratos de carbono, sendo a frutose (38 %) e a glucose (31 %) maioritariamente resultantes da atividade da invertase. Além disso, vários oligossacarídeos foram identificados no mel, constituindo 5 a 10 % do total dos açúcares. A origem destes oligossacarídeos ainda é incerta, uma vez que a maioria não é reportada nem no néctar nem no pólen. A investigação desta temática, maioritariamente conduzida no século passado, demonstraram a capacidade da invertase, designadamente a atividade de α-glucosidase, em transferir resíduos α-glucosyl para grupos funcionais de outros hidratos de carbono. Uma vez que esta atividade de transglucosilação foi reportada tanto para a invertase das abelhas como do mel, especulou-se que a ação desta enzima estivesse na origem dos açúcares com ligações de α-glucose. No entanto, ainda não existe uma explicação para a origem dos restantes oligossacarídeos. O presente trabalho coloca a hipótese de que reações não enzimáticas possam ocorrer no mel, promovendo a formação de oligossacarídeos. Esta hipótese pode ser suportada pelo facto das condições de maturação do mel, como as concentrações elevadas de açúcar em meio ácido, induzirem à condensação dos hidratos de carbono, reações também designadas por reações de reversão. De forma a validar esta hipótese, seis soluções modelo aquosas (teor de humidade de 20 %) de sacarose com glucose e de sacarose com frutose foram preparadas com ácido cítrico diluído a pH 4.0, a pH 2.0 e sem adição de ácido. As soluções foram mantidas numa estufa a 35⁰C, correspondente à temperatura média no interior da colmeia aquando da criação do ninho. Também se acedeu à influência das condições de maturação do mel no seu perfil de oligossacarídeos, através da análise de méis com diferentes propriedades, destacando-se a duração e o tempo de maturação. As análises de ionização em electrospray acopladas a espectrometria de massa (ESI-MS) permitiram monitorizar as alterações que ocorreram nas soluções durante 5 meses. Este método revelou a ocorrência da síntese de oligossacarídeos não enzimática, com um DP máximo observado de 6, após 5 meses. A separação dos açúcares formados nas soluções modelo e presentes nos méis através de cromatografia de afinidade e de exclusão-molecular (LEX-SEC) e a análise de metilação permitiram observar que os oligossacarídeos produzidos tinham uma composição em ligações glicosídicas semelhante à dos oligossacarídeos do mel. A maioria das frações era composta principalmente por resíduos de glucose ligados pelo terminal e por resíduos de fructose ligada terminalmente e, em menor quantidade, por resíduos de glucose com ligações (1->2), (1->4) e (1->6) e por resíduos de frutose com ligações (2->1), (2->3) e (2->6). Também foram identificados resíduos correspondentes a ramificações, sendo o (1->2,3,4,6) -Glc o mais abundante e encontrado predominantemente em soluções elaboradas com ácido cítrico. A estrutura e a identidade dos oligossacarídeos anteriormente mencionados foram clarificados através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa, após derivatização nos seus acetatos de alditol.