Study of the impact of mRNA mistranslation in lipid homeostasis

Abstract

Erroneous mRNA translation (mistranslation) originates a statistical proteome. Previous studies in different model organisms proved that mistranslation is generally deleterious in standard growth conditions. Particularly in yeast, different types of amino acid misincorporation cause phenotypic diversity, including mitochondrial dysfunction, proteotoxic and oxidative stress, DNA damage, transcriptome deregulation, among others. Proteotoxic stress alone is known to trigger alterations in lipid metabolism. In agreement with these observations, the induction of amino acid misincorporation deregulates lipid metabolism-related genes. The link between mistranslation and lipid-related diseases has been also established, namely in the well-known Barth syndrome. However, the cellular processes affected in the case of several other diseases are still unclear. In this thesis, we attempted to elucidate the effects of mRNA mistranslation on the lipidome and showed the occurrence of altered lipid profiles. We expressed a recombinant seryl-tRNA gene in Saccharomyces cerevisiae in order to induce mistranslation. The anticodon of this tRNA was mutated to recognize alanine or glycine codons, and hence introduce serine at protein sites that normally correspond to alanine or glycine. Total lipid extracts analysed using a lipidomics approach revealed altered fatty acid, phospholipid and triacylglycerol species profiles. The same methods were used to analyse purified mitochondria. In this case, only the profiles of phospholipid species were altered. Functional and molecular studies, showed no evidence of increased oxidative stress; there were alterations in OLE1 expression, the gene that codes for a fatty acid desaturase. Mitochondrial function-related parameters were also tested and were altered. Finally, we sought to understand whether mRNA mistranslation impacted the genome, and in particular, we searched for mutations in lipid metabolism-related genes. For this, we evolved our strains for 250 generations and sequenced their genomes. Overall, the data show that serine misincorporation at alanine and glycine sites perturbs lipid homeostasis.

Os erros de tradução do mRNA resultam na incorporação errada de aminoácidos nas proteínas, levando à produção de um proteoma estatístico. Verificou-se anteriormente que o erro de tradução é por norma prejudicial em condições de crescimento padrão, em diferentes organismos modelo. Na levedura, a indução da incorporação errada de aminoácidos nas proteínas causa um conjunto variado de fenótipos, incluindo perturbação da função mitocondrial, stress oxidativo e proteotóxico, danos no ADN, desregulação do transcriptoma, entre outros. Por si só, o aumento do stress proteotóxico provoca alterações no metabolismo dos lípidos. Em concordância, o aumento da incorporação errada de aminoácidos desregula a expressão de genes ligados a este mesmo metabolismo. Foi já estabelecida a ligação entre os erros de tradução e doenças relacionadas com lípidos como, por exemplo, a síndroma de Barth. No entanto, noutros casos, os mecanismos celulares afetados estão ainda por clarificar. Especificamente no nosso modelo o impacto do erro de tradução no lipidoma ainda não é conhecido e a existência de perfis lipídicos alterados não foi ainda comprovada experimentalmente. De modo a esclarecer esta questão, um gene recombinante de um tRNA de serina foi expresso em Saccharomyces cerevisiae. O anticodão deste gene reconhece codões de alanina ou glicina, inserindo serina nas proteínas em locais onde originalmente estariam alanina e glicina. Os extratos lipídicos celulares foram analisados usando uma abordagem lipidómica, tendo-se observado a alteração nos perfis de ácidos gordos e espécies de fosfolípidos e triacilglicerol. Adicionalmente, repetiu-se a abordagem em extratos lipídicos de mitocôndrias purificadas e os resultados obtidos mostraram alterações dos perfis de fosfolípidos. O passo seguinte consistiu em aprofundar o novo conhecimento com estudos funcionais e moleculares. Estas estirpes não revelaram um aumento dos níveis de oxidação, mas houve indicação da ocorrência de alterações no processo de dessaturação de ácidos gordos. Os parâmetros relacionados com a função mitocondrial também foram testados e revelaram-se alterados. Por fim, com o objetivo de perceber possíveis adaptações ao nível do genoma e, em particular, em genes relacionados com o metabolismo lipídico, as estirpes foram evoluídas no laboratório até cerca de 250 gerações, e os seus genomas foram sequenciados. Os dados mostram que a incorporação de serina em locais de alanina ou glicina, a nível do proteoma, perturba homeostasia lipídica.