Unravelling the cellular networks that regulate proteotoxic stress

Abstract

Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Errors occur at frequencies around 10-4 under normal physiological conditions and are tolerated by cells. If the frequency of these basal errors increases, the mechanisms of protein quality control become overload, leading to accumulation of misfolded proteins that may aggregate. Several conditions have been associated to this phenomenon, namely aging and neurodegeneration. But, the cause-effect mechanisms remain to be clarified in many cases. In order to elucidate how human cells respond to the accumulation of protein synthesis errors (mistranslation) throughout time, we have developed a methodology that allows for the random serine misincorporation in proteins on a proteome wide scale. The anticodon of a human serine tRNA was mutated to read non-cognate codons. HEK293 cells expressing these tRNAs accumulate ubiquitinated proteins and in some cases protein aggregates. Despite this, only slight alterations in proliferation and viability were detected after several passages in culture. Here we show that activation of quality control pathways, namely molecular chaperones, ubiquitin-proteasome system and unfolded protein response was dependent on the type of amino acid misincorporation. In addition, we observed that evolution of these cell lines in culture deregulates gene expression, for example genes involved in endoplasmic reticulum stress and glycolysis were upregulated. Whole-exome sequencing of evolved cell lines revealed that our cells accumulate a small number of mutations comparatively to the control cell line, in genes involved in transcription and RNA binding. Our data indicate that HEK293 cells adapt to protein synthesis errors mainly through activation of protein quality control mechanisms and other cellular processes depending on the type of amino acid substitution and cells passage number. This study reveals new insights on how human cells adapt to protein synthesis errors and the consequent accumulation of aberrant proteins.

A manutenção da fidelidade durante o processo de síntese proteica é de extrema importância para a estabilidade das proteínas e o normal funcionamento dos processos celulares. Há erros que ocorrem durante este processo a uma taxa de 10-4, a um nível fisiológico, sendo tolerados pelas células. Quando a taxa de erro aumenta os mecanismos de controlo de qualidade de proteínas ficam sobrecarregados, levando à acumulação de proteínas aberrantes que podem agregar. O envelhecimento e neurodegeneração têm sido associados ao aumento de erros durante a síntese de proteínas, mas até agora pouco se sabe acerca dos mecanismos causa-efeito envolvidos nestes processos. De forma a entender como as células humanas se adaptam ao longo do tempo aos erros na síntese de proteínas, desenvolvemos uma metodologia que permite a incorporação errónea de aminoácidos de uma forma aleatória nas proteínas. Para tal, mutámos o anticodão de um tRNA de serina humano, de forma a incorpoporar serina em codões de outros aminoácidos. Para além disto, também sobre-expressámos o tRNA de Serina em células HEK293. As células que expressam estes tRNAs, acumularam proteínas ubiquitinadas e em alguns casos agregados proteicos. Apesar disto, não se observaram grandes alterações na proliferação e viabilidade destas células após várias passagens em cultura. Os mecanismos de controlo de qualidade de proteínas, nomeadamente o sistema ubiquitina-proteasoma, o sistema de resposta a proteínas aberrantes no retículo endoplasmático e os chaperones moleculares, foram activados de forma diferencial de acordo com o tipo de aminoácidos substituídos nas proteínas. Observámos também que a evolução destas linhas em cultura levou a alterações ao nível da expressão génica, como a sobre-expressão de genes envolvidos na resposta ao stress do retículo endoplasmático e glicólise. A sequenciação do exoma das linhas celulares evoluídas permitiu-nos concluir que estas células acumularam poucas mutações comparativamente com a linha controlo. A maior parte dos genes mutados, ao longo do tempo, estão envolvidos em processos como a transcrição e ligação do RNA. Os nossos dados indicam, assim, que as células HEK293 se adaptam aos erros que ocorrem durante a síntese proteica, activando mecanismos de controlo de qualidade de proteínas e alterando a expressão génica. A activação destes mecanismos é dependente do tipo de erros translacionais e da passagem em que as células se encontram. Este estudo revela-nos um pouco mais acerca de como as células humanas se adaptam aos erros que ocorrem durante a síntese proteica.