Characterizing Alzeimer's amyloid precursor protein (APP) neurotrophic functions

Abstract

The Amyloid Precursor Protein (APP) is a type 1 membrane glycoprotein, mainly known as the precursor of the amyloid β-peptide, a central player in Alzheimer’s disease. Nevertheless, APP has been established as a neuromodulator of developing and mature nervous system. Alterations in the level or activity of APP and APP fragments seem to play a critical role in several neurodegenerative and neurodevelopment disorders. APP is a complex molecule due to the intricate relationships between its intracellular trafficking, posttranslational modifications, proteolytic cleavages, and multiple protein interactors. Various studies currently address the physiological roles of APP and its fragments, but there are contradictory results and missing pieces that need further work. The main objective of this thesis was to contribute to the characterization of the role of APP in neuronal differentiation. Particularly, we focused on mechanisms mediated by APP, its fragment sAPP, and APP phosphorylation at serine 655. First, we characterized the APP protein in Retinoic Acid (RA)-induced SHSY5Y cell differentiation. The comprehensive analysis of this model exposed a biphasic temporal response: a first early phase (D0-D4), where a sAPP/APP peak assists the emergence of new processes and their elongation into neurites; and a second phase (D4-D8) when increased holoAPP protein levels are necessary to sustain neuritic elongation and stabilization. In line with our main aim, we subsequently characterized the relationship between APP and the neurotrophic EGF-EGFR-ERK signaling pathway. We showed, for the first time, that APP interacts with proEGF, and confirmed the interaction with EGFR. Furthermore, we showed that combined APP and EGF have a synergistic effect on neuronal-like differentiation, related to enhanced ERK1/2 activation, and observed that APP modulates EGFR expression levels and trafficking. Both ERK1/2 activation and EGFR seem to be modulated by the APP S655 phosphorylation state, and phosphorylation at this residue favours dendritogenesis in mice cortical neurons. Finally, we focused on discovering APP protein interactors dependent on S655 phosphorylation and with a role in neuronal differentiation. SH-SY5Y differentiated cells, overexpressing APPWt or S655 phosphomutants, were used to immunoprecipitate the specific APP proteins and their respective interacting partners, later identified by mass spectrometry. The dephosphoS655 APP interactome was enriched in functions associated with cytoskeleton organization, and these cells were particularly associated with actin remodeling. The phosphoS655 APP interactome included proteins involved in the regulation of survival and differentiation, and in various signaling pathways, correlating well with an enhanced neurite outgrowth displayed by these cells. We hope that the knowledge here gathered can contribute to a better comprehension of APP-driven neurotrophic roles and underlying mechanisms.

A Proteína Precursora de Amilóide (APP) é uma proteína membranar mais conhecida por ser precursora do péptido Amilóide β, tendo por isso um papel central na doença de Alzheimer. Não obstante, a APP tem sido reconhecida como neuromodulador do sistema nervoso central. Alterações nos níveis ou na atividade da APP e seus fragmentos estão implicadas em diferentes doenças neurológicas. As relações entre o seu transporte intracelular, modificações pós-traducionais, corte proteolítico, e proteínas com as quais interage são complexas e multifacetadas. Talvez por isso, estudos focados no papel fisiológico da APP apresentem resultados contraditórios e muitas questões em aberto. O objetivo deste trabalho consistiu na caracterização do papel fisiológico da APP na diferenciação neuronal. Particularmente, focámo-nos nos mecanismos mediados pela APP e fragmento sAPP, e a fosforilação da APP no resíduo serina 655. Inicialmente, caracterizámos a proteína APP ao longo da diferenciação de células SH-SY5Y com ácido retinóico (RA). A análise sistemática deste modelo permitiu delimitar uma resposta bifásica: na primeira fase (D0-D4), um pico de sAPP/APP acompanha o aparecimento de novos processos e o crescimento a neurites; na segunda fase (D4-D8) o aumento nos níveis da APP suporta o crescimento e manutenção das neurites. Caracterizámos posteriormente a relação entre a APP e a via de sinalização EGF-EGFR-ERK na diferenciação neuronal. Demonstrámos, pela primeira vez, que a APP interage com o proEGF, e confirmámos a sua ligação ao EGFR. Adicionalmente, observámos que a APP e o EGF têm um efeito sinérgico na diferenciação tipo-neuronal e aumento da ativação da ERK1/2, e que a APP afeta os níveis e transporte do EGFR. Estes mecanismos são modulados pela fosforilação da APP na S655, que favorece a dendritogénese em neurónios corticais de ratinho. Por último, focámo-nos na identificação de proteínas interatoras da APP dependentes da fosforilação em S655 e com função na diferenciação neuronal. Usando células SH-SY5Y diferenciadas e a sobrexpressar a APPWt ou fosfomutantes da S655, imunoprecipitámos as diferentes APPs e seus interatores, posteriormente identificados por espectrometria de massa. O interatoma da APP desfosforilada é enriquecido em funções associadas à organização do citoesqueleto, levando a uma maior reorganização da actina. O interatoma da APP fosforilada incluí proteínas envolvidas na regulação de sobrevivência e diferenciação, e em várias vias de sinalização, o que se correlaciona com o favorecimento de neurites nestas células. Com este trabalho esperamos ter contribuído para uma melhor compreensão do papel neurotrófico da APP e dos mecanismos subjacentes a este.