Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/22043
Title: Lanthipeptides of Archaea : the case study of Haloferax mediterranei
Other Titles: Lantipéptidos em Archaea: o caso de estudo de Haloferax mediterranei
Author: Costa, Hugo Filipe Rangel da
Advisor: Caetano, Tânia Isabel Sousa
Barroso, Sónia Alexandra Leite Velho Mendo
Keywords: Ecossistemas aquáticos
Plâncton marinho
Péptidos
Defense Date: 3-Jan-2018
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Os produtos naturais são ainda hoje a maior fonte de descoberta de novas moléculas. Os lantipéptidos são um grupo de produtos naturais que pertencem à família de péptidos sintetizados pelos ribossomas e sujeitos a modificações pós-traducionais (RiPPs). Estas modificações incluem a desidratação de Ser e Thr e a ciclização entre estes aminoácidos desidratados e a Cys, dando origem aos característicos anéis de lantionina (Lan) e/ou metilantionina (MeLan). Estas reações são catalisadas por diferentes tipos de enzimas (LanB, LanM, LanKC e LanL), que constituem a base da classificação destes péptidos. Estas proteínas são codificadas em várias espécies de bactérias e possuem homólogos tanto no domínio Eukarya como no domínio Archaea. Os objectivos deste trabalho foram: i) identificar os clusters de lantipéptidos presentes no genomas de Archaea, recorrendo a bases de dados públicas, ii) caracterizar os clusters identificados e, por último, iii) identificar os padrões de desidratação e ciclização dos lantipéptidos encontrados em Haloferax mediterranei ATCC 33500. Em Archaea foram detectados apenas genes lanM, que estão confinados aos genomas de organismos pertencentes à classe Halobacteria. Uma procura “manual” in silico na região genómica de cada lanM permitiu identificar a presença de vários genes lanA. A análise da sequência dos lantipéptidos codificados por estes lanAs não identificou motivos conservados, mas permitiu a sua divisão em grupos diferentes. Os clusters que contêm estes genes também codificam proteínas de função desconhecida e transportadores ABC. Nenhum destes transportadores é do tipo SunT (LanT) que estão normalmente associados ao processamento de lantipéptidos modificados por LanMs. Haloferax mediterranei ATCC 33500 foi selecionado para uma caracterização mais aprofundada uma vez que possui três genes lanM: um no cromossoma (medM1) e dois num plasmídeo (medM2 e medM3). Foram construídos três vetores que permitiram a co-expressão dos genes medM e His6-medA em Escherichia coli. Após produção, purificação por IMAC e análise por MALDI-TOF, verificou-se que nenhum dos péptidos foi desidratado. Desta forma, as enzimas MedM não parecem estar funcionais no citoplasma de E. coli, necessitando provavelmente de elevadas concentrações de sal para exercer as suas funções. Desta forma, utilizou-se um outro hospedeiro para expressão heteróloga: a Archaea Haloferax volcanii H1424. Para tal, foram construídos novos vectores de co-expressão baseados no plasmídeo pTA1392, contendo dois promotores (e não apenas um como na versão original). Após transformação de H. volcanii, os péptidos foram produzidos e purificados por IMAC. A análise por MALDI-TOF, não revelou a presença de nenhum dos His6-MedA. Consequentemente, será necessário optimizar os protocolos de produção e/ou purificação destes péptidos de H. volcanii. O sucesso desta optimização permitirá provar a funcionalidade das enzimas MedM e estabelecer um sistema de expressão de natureza halófita que poderá ser útil para o estudo de outros clusters biosintéticos de Archaea. Concluindo, organismos do domínio Archaea, em particular Halobacteria, codificam enzimas envolvidas na biossíntese de lantipéptidos homólogas às encontradas em bactérias. Os lantipéptidos de bactérias normalmente são bacteriocinas. Se os lantipéptidos de Archaea possuírem atividade contra outras Archaea (archaeocinas), poderão ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de novos marcadores seletivos. Isto permitirá melhorar as ferramentas existentes para manipulação genética de Archaea.
Natural products are to this day the major source of novel molecules. Lanthipeptides are a group of natural products belonging to the family of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs). Their modifications include the dehydration of Ser and Thr residues immediately followed by a cyclization reaction between the dehydrated amino acids and Cys to form their characteristic lanthionine (Lan) and/or methyllanthionine (MeLan) rings. These reactions are catalyzed by different types of enzymes (LanB, LanM, LanKC and LanL), that define the classification of lanthipeptides. These proteins are encoded in a wide range of bacterial species and have homologues also in Eukarya and Archaea. The objectives of this work were: i) identify lanthipeptide clusters in the publicly available archaeal genomes, ii) characterize the archaeal lanthipeptide gene clusters and iii) identify the dehydration and cyclization pattern of putative lanthipeptides from Haloferax mediterranei ATCC 33500. Archaea encodes exclusively LanM enzymes (21 lanM genes) and they are confined to organisms of the class Halobacteria. Manual search of the genetic neighborhood of each lanM allowed to identify several lanA genes. The putative lanthipeptides encoded by these lanAs do not share conserved motifs but, based on their sequences, they can be divided into groups. Their gene clusters also encode proteins of unknown function and ABC transporters. None of these transporters are of the SunT-type (LanT) that is classically involved in the processing of LanM-modified lanthipeptides. Haloferax mediterranei ATCC 33500 was selected for further characterization because it has three lanM genes: one on the chromosome (medM1) and two on a plasmid (medM2 e medM3). Three expression vectors were constructed to allow the co-expression of medM and His6-medA genes in Escherichia coli. After production, purification by IMAC and MALDI-ToF analysis, it was found that none of the peptides were dehydrated. This indicates that MedM enzymes are not functional in E. coli cytoplasm. Most probably, their functionality is dependent on high concentrations of salt. Therefore, another heterologous expression host was used: the archaeon Haloferax volcanii H1424. To this purpose, new co-expression vectors were constructed based on the pTA1392 plasmid and containing two promoters, instead of the original one. After transformation of H. volcanii, peptide production, IMAC purification and MALDI-ToF analysis, none of the His6-MedA peptides were identified. Thus, in the future, optimization of the production procedures and/or purification of these peptides from H. volcanii will be needed. This will prove the functionality of MedM enzymes and will establish a system with halofilic nature that can be useful for the investigation of other biosynthetic clusters from Archaea. In conclusion, Archaea, in particular Halobacteria, encode lanthipeptide enzymes that are homologous to those found in Bacteria. In Bacteria, these peptides commonly have antibacterial activity. If archaeal lanthipeptides are archaeocins, these peptides will be a valuable tool for the development of novel selective markers for Archaea. This will be highly relevant to improve the tool-box for the genetic manipulation of Archaea.
Description: Mestrado em Biologia Molecular e Celular
URI: http://hdl.handle.net/10773/22043
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