Detection and characterization of phenoloxidasse in Chironomus riparius

Abstract

Insects are frequently exposed to a large variety of microbes, microorganisms and parasites which requires an effective immune system of defence against infections. However, insects lack an adaptive immune system, so they have developed other highly effective systems of host defence, such as innate immune reactions. These innate immune reactions refer to the first-line of defence of hosts against bacterial, fungal, and viral pathogens. Research on invertebrate model systems have been increasing and becoming very important in ecological immunology research. One of the most important immune component used by insects is melanogenesis, which is responsible for encapsulation followed by melanization of the pathogens. Melanization requires activation of a key enzyme – phenoloxidase (PO), during PO cascade which is the major humoral immune effector system. Due to the importance of PO on insect immune system, the aims of the present study were to characterize PO activity in samples of C. riparius larvae whole body homogenates, and evaluate the sensitivity of PO activity as an indicator of effects of two widely used bio insecticides - Naturalis®-L and VectoBac® 12AS. The results demonstrated that proPO present in C. riparius samples was readily activated by the presence of chymotrypsin, zymosan and lipopolysaccharide. On the other hand, 1-phenyl-2-thiourea inhibited PO activity. In vivo exposures, PO activity was significantly increased ~ 5 and 6 abs / mg protein in samples exposed to 2 and 5 mg/L of Naturalis®-L and ~ 4 abs / mg protein in samples exposed to 20 ng/L VectoBac® 12AS, in comparison with unexposed organisms (~ 2 abs/mg of protein). This activity increased even more with the presence of chymotrypsin. Also the results suggest de novo synthesis of proPO under exposure to bio insecticides. Thus, this study confirmed the presence of a true PO, due to the inhibition caused by the PTU. We concluded that the measurement of PO activity and activation of proPO can and should be used as an immunological biomarker, providing information on the immunological status of the organism and on sub-lethal responses to stress.

Os insetos estão expostos, diariamente, a uma ampla variedade de microrganismos e parasitas, necessitando, assim, de um sistema imunitário extremamente eficiente que seja capaz de os proteger de possíveis infeções causadas por esses agentes externos. Contudo, estes organismos não possuem sistema imunitário adaptativo, pelo que recorrem a outros tipos de defesa igualmente eficazes, como as reações imunitárias inatas. Estas reações constituem a primeira linha de defesa do hospedeiro contra bactérias, fungos e vírus. O estudo do sistema imunitário inato tem ganho grande relevância em imunologia e ecologia de vários tipos de invertebrados, dada a sua importância na defesa destes hospedeiros. Desta forma, um dos processos imunológicos mais importantes nos insetos é a melanogénese, que leva a um encapsulamento dos agentes invasores seguido de melanização. A melanização requer a ativação de uma enzima chave – fenoloxidase (PO), principal efetor do sistema humoral, que se torna ativa através da cascata de ativação de proPO. Assim, e tendo em conta o papel fundamental que esta enzima tem no sistema imunitário dos invertebrados, o presente estudo teve como objetivos caracterizar a atividade de PO em amostras de C. riparius e avaliar a sensibilidade da atividade de PO como indicador de efeitos causados por dois bio inseticidas muito usados - Naturalis®-L e VectoBac® 12AS. Os resultados demonstraram que a atividade de proPO presente nas amostras de C. riparius foi prontamente ativada pela presença de quimotripsina, zimosan e lipopolissacarídeos. Por outro lado, a atividade de PO sofreu grande inibição na presença de 1-fenil-2-tioureia. A atividade de PO aumentou significativamente para ~ 5 and 6 abs/mg de proteína em amostras expostas a 2 and 5 mg/mL de Naturalis®-L, e para ~ 4 abs/mg de proteína em amostras expostas a 20 mg/mL de VectoBac® 12AS, comparativamente ao controlo (~ 2 abs/mg de proteína). Quando as amostras foram expostas in vitro a quimotripsina, esta atividade aumentou para além destes valores, indicando síntese de novo de proPO. Assim, este estudo permitiu confirmar que estamos na presença de uma verdadeira atividade de PO, dada a acentuada inibição causada por PTU. E concluiu-se que a medição da atividade de PO e ativação de proPO pode e deve ser utilizada como um biomarcador imunológico em insetos, providenciando informação acerca do status imunológico do organismo e a capacidade deste responder a um agente infecioso, bem como a suscetibilidade do organismo ao mesmo, ou a outros que possam surgir simultaneamente. agente do sistema humoral, que se L de Naturalis®-L, e para ~ 4 abs/mg de proteína em amostras expostas a 20 ng/L de VectoBac® 12AS, comparativamente a organismos não expostos (~ 2 abs/mg proteína), revelando a sensibilidade deste parâmetro à exposição a agentes patogénicos. A atividade de PO aumentou na presença quimotripsina. Além disso, os resultados sugerem síntese de novo de proPO em organismos expostos a bio inseticidas. Assim, este estudo permitiu confirmar que estamos na presença de uma verdadeira atividade de PO, dada a acentuada inibição causada por PTU. E concluiu-se que a medição da atividade de PO e ativação de proPO pode e deve ser utilizada como um biomarcador em insetos, providenciando informação acerca da condição imunológica do organismo e a respostas a stressores ambientais.