Developmental, behavioral, biochemical and epigenetic effect of pharmaceuticals in larvae and embryos of Danio rerio

Abstract

The scientific community has been concerned for several years about the presence of pharmaceuticals in the wild, since these compounds may have deleterious or unpredictable effects on living organisms. The scientific knowledge on the fate and effect of drug residues in the environment has evolved considerably in recent years, revealing that drug residues do indeed pose a threat to the aquatic ecosystem. Two examples of widely used pharmaceuticals that are present in the environment are paracetamol (acetaminophen) and ciprofloxacin, Paracetamol is a drug with analgesic properties, used for the temporary relief of mild to moderate pain associated with common colds, and in the reduction of fever. Ciprofloxacin is an antibiotic from the chemical class of the fluoroquinolones which presents a broad antibacterial spectrum. Firstly we decided the range of concentrations for each drug. In the case of paracetamol, the tested concentrations were 0.005 mg/L, 0.025 mg/L, 0.125 mg/L, 0.625 mg/L, and 3.125 mg/L, plus a control treatment with water from the facility system. And for ciprofloxacin, the tested concentrations were 0.005 μg/L, 0.013 μg/L, 0.031 μg/L, 0.078 μg/L, 0.195 μg/L, and 0.488 μg/L. These concentrations were chosen as for their environmental relevance since they are close to the real concentrations of these pharmaceuticals found in surface waters and effluents. This work aims to characterize the effects of both drugs in zebrafish embryos and larvae, not only in developmental and behaviour parameters, but also using a biomarker-based approach, namely by quantifying the activities of catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST’s), cholinesterases (ChE’s), glutathione peroxidase (GPx), and determining the TBARS level. Exposure to paracetamol caused an increase in the percentage of organisms with morphological deformations, but no morphological deformations were observed in organisms exposed to ciprofloxacin. Concerning larvae behavioural tests, significant differences were observed for larvae exposed to paracetamol but not for larvae exposed to ciprofloxacin. In the biomarker determination, both drugs caused a statistically significant increase in ChE activity; in CAT only ciprofloxacin caused a significant difference, a decrease in its activity. Paracetamol induced an increase in activity for total GPx and in GST’s. The TBARS levels significantly increased in the exposure to paracetamol, but they significantly decreased in the exposure to ciprofloxacin. In this work, we also prepared an immunohistochemical detection of global methylation, which allowed to observe that, in embryos, the highest concentration of paracetamol caused a slight increase in the intensity of the 5- mdC signal, which can be translated into a slight increase in the DNA methylation. On the other hand, the embryos exposed to ciprofloxacin did not appear to have any difference from control. The comparison of the here-obtained results for the two different drugs allows observing that zebrafish larvae were more sensitive to the exposure to paracetamol, being the most sensitive methodology the biomarker determination. We can also conclude that oxidative stress occurred as a consequence of the exposure to both pharmaceuticals, being more evident in the case of paracetamol. We also showed that the oxidative stress created by the two pharmaceuticals may be the cause of all the other observations.

A presença de produtos farmacêuticos na natureza é uma questão emergente para a comunidade científica uma vez que estes compostos podem ter efeitos deletérios ou imprevisíveis sobre os organismos vivos. O estudo dos efeitos dos resíduos de medicamentos no ambiente evoluiu consideravelmente nos últimos anos, revelando que estes resíduos são uma ameaça para o ecossistema aquático. Dois exemplos de produtos farmacêuticos amplamente utilizados por humanos e presentes no meio ambiente são o paracetamol (acetaminofeno) e a ciprofloxacina. O paracetamol é um medicamento com propriedades analgésicas, utilizado para o alívio temporário da dor leve a moderada associada a gripes comuns, e na redução da febre. A ciprofloxacina é um antibiótico da classe química das fluoroquinolonas que apresenta um amplo espectro antibacteriano. Este trabalho tem como objetivo utilizar larvas de peixe-zebra e caracterizar os efeitos de ambos os medicamentos, não apenas nos parâmetros de desenvolvimento e comportamento, mas também usando com uma abordagem baseada em biomarcadores, nomeadamente quantificando as atividades de catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), colinesterases (ChE's), glutationa peroxidase (GPx) e determinação do nível TBARS, bem como uma abordagem epigenética. Neste trabalho, também avaliamos por técnicas histoquímicas a metilação global do ADN. No caso do paracetamol, as concentrações testadas foram 0.005 mg/L, 0.025 mg/L, 0.125 mg/L, 0.625 mg/L, e 3.125 mg/L, juntamente com o controlo que apenas continha água do sistema. Para a ciprofloxacina, as concentrações testadas foram 0.005 μg/L, 0.013 μg/L, 0.031 μg/L, 0.078 μg/L, 0.195 μg/L, e 0.488 μg/L. Estas concentrações foram escolhidas pela sua relevância ambiental, uma vez que são muito próximas às concentrações destes fármacos no ambiente. A exposição ao paracetamol causou um aumento na percentagem de organismos com deformações morfológicas, mas não foram observadas deformações morfológicas em organismos expostos à ciprofloxacina. Quanto aos testes comportamentais com larvas de peixe-zebra, observaram-se diferenças significativas nas larvas expostas ao paracetamol, que demonstraram uma maior distância de natação, mas o mesmo efeito não foi observado para as larvas expostas à ciprofloxacina. Os dados obtidos para os diferentes biomarcadores demonstraram que ambos os fármacos causaram um aumento estatisticamente significativo na atividade de ChE. Na actividade da CAT, apenas a ciprofloxacina causou diferença significativa, mais propriamente uma descida na atividade da CAT. O paracetamol induziu um aumento na atividade da GPx total e das GSTs. Os níveis de TBARS aumentaram significativamente após exposição ao paracetamol, mas diminuíram significativamente em organismos expostos à ciprofloxacina.

Os dados relativos à quantificação da metilação global do ADN permitiram observar que, em embriões, a maior concentração de paracetamol causou um ligeiro aumento na intensidade do sinal do marcador de metilação de ADN (5- mdC,) quando observado por miscroscopia de confocal. Por outro lado, os embriões expostos à ciprofloxacina não aparentavam ter qualquer diferença no perfil deste marcador de epigenética comparativamente ao controlo. A comparação dos resultados aqui obtidos para os dois fármacos diferentes permite observar que as larvas de peixe zebra eram mais sensíveis à exposição ao paracetamol, sendo a metodologia mais sensível a determinação do biomarcador. Também podemos concluir que o estresse oxidativo ocorreu como conseqüência da exposição a ambos os produtos farmacêuticos, sendo mais evidente no caso do paracetamol. Também mostramos que o estresse oxidativo criado pelos dois produtos farmacêuticos pode ser a causa de todas as outras observações.