Identification of human tRNA modifying enzymes involved in protein aggregation

Abstract

As doenças conformacionais são caracterizadas pela acumulação de agregados proteicos, destabilização da síntese de proteínas e stress proteotóxico devido a mutações, desregulação da rede de stress e defeitos na maquinaria de tradução. No entanto, os mecanismos subjacentes a estes fenótipos ainda não são totalmente compreendidos. Os tRNAs são moléculas essenciais para a tradução e são extensamente modificados. Estas modificações são essenciais para a estabilidade do tRNA e para o correto emparelhamento codão-anticodão e são catalisadas por diferentes classes de enzimas modificadoras de tRNA. Recentemente, algumas dessas enzimas, em particular as que catalisam modificações na região do anticodão do tRNA foram encontradas desreguladas em várias doenças, nomeadamente cancro, distúrbios metabólicos e neurológicos. A ligação entre as enzimas modificadoras de tRNA e o stress proteotóxico como mecanismo subjacente da doença não se encontra experimentalmente demonstrada. Assim, estabelecemos a hipótese de que a desregulação destas enzimas - especialmente aquelas que catalisam modificações na posição 34 - afetam a fidelidade da tradução, resultando na agregação de proteínas e na ativação da UPR, características das doenças acima mencionadas. Para testar esta hipótese, implementámos um método fluorescente baseado em siRNAs em células HeLa expressando um sistema repórter de agregação desenvolvido por nós. Das enzimas testadas, o silenciamento das que pertencem ao Elongator Acetyltransferase Complex (ELP) levou à acumulação mais marcante de focos fluorescentes nas células, indicando a ocorrência de agregação de proteínas. Experiências adicionais demonstraram que a taxa de síntese proteica é afetada, bem como a morfologia mitocondrial e alguns mecanismos de controlo de qualidade. Este estudo preliminar demonstra pela primeira vez, em células de mamífero que existe uma ligação entre as enzimas modificadoras de tRNA e a acumulação de agregados proteicos, indicando que estas moléculas podem ser importantes alvos terapêuticos nas doenças conformacionais.

Protein conformational diseases are characterized by accumulation of protein aggregates, impaired protein synthesis and proteotoxic stress due to mutations, down regulation of the stress network and defects in the translation machinery. However, the mechanisms underlying these phenotypes are not yet understood. tRNAs are main players of the translation machinery and tRNA modifications are essential for efficient codon-anticodon recognition influencing translation efficiency. These modifications are catalyzed by different classes of tRNA modifying enzymes that have been found deregulated in several diseases, namely cancer, metabolic and neurological disorders. The connection between tRNA modifying enzymes and proteotoxic stress as an underlying mechanism of disease was not experimentally demonstrated. We have hypothesized that deregulation of these enzymes - especially those that catalyze modifications at position 34 - affect translation fidelity, resulting in protein aggregation and UPR activation, hallmarks of the above-mentioned diseases. To test this hypothesis, we implemented a tRNA modifying enzyme fluorescent based siRNA screen in HeLa cells expressing a protein aggregation reporter system developed by us. From all the tested enzymes, knockdown of the ones belonging to the Elongator Acetyltransferase Complex (ELP) family led to the most striking accumulation of fluorescent foci in cells, indicating that protein aggregation was occurring. Additional experiments demonstrated that protein synthesis, mitochondrial morphology and some quality control mechanisms were also affected. This preliminary study demonstrates for the first time in mammalian cells a relation between tRNA modifying enzymes deregulation and accumulation of protein aggregates, indicating that these enzymes can constitute relevant novel therapeutic targets in conformational diseases.