Evaluation of the cytotoxic potential of graphene nanomaterials

Abstract

Graphene is a single-atom thick, two-dimensional sheet of hexagonally arranged carbon atoms and since its isolation, its properties have been widely studied, and graphene and graphene-based nanomaterials are now applied in several fields. Several types of graphene-family nanomaterials (GFN) have been synthesized and widely applied, but there is still some misunderstanding about their potential effects on human health, especially since these nanomaterials can be easily inhaled, especially in the manufacturing process, if they are not properly cared for. In this work, a set of graphene family compounds were selected for the evaluation of their cytotoxic effects on RAW264.7 macrophages. The well-characterized Carbon black nanomaterial was used as reference. Cells were exposed to the BMD30 and 0.5 BMD30 doses defined in previous studies. The internalization of the different GFNs (graphene-family nanomaterials) compounds by RAW264.7 cells was evaluated, as well as its potential oxidative effects by the evaluation of the production of reactive oxygen species (ROS). The GFNs P4, P5 and P6 were selected for further studies due to their highest toxicity potential. The mechanisms of GFNs induced cell death were studied for P4, P5 and P6 by the evaluation of the percentage of cells under apoptosis/necrosis and the mitochondrial membrane potential. The results showed that all the GFNs tested were internalized by RAW 264.7 cells, but P3, P4 and P5 (carboxyl graphene, graphene nanoplatelets and single layer graphene oxide, respectively) were internalized at higher ratios. For P1, P2, P3, P5 and P6 an increase in nanomaterial internalization with exposure duration was observed. Furthermore, the GFNs P2, P3, P4, P6, and P8 showed an increase of ROS production at 0.5BMD30 but not at BMD30 concentrations. The results showed that P4 and P5 increased the number of apoptotic cells and decreased mitochondrial membrane potential of RAW 264.7 cells. Overall our results demonstrate that the toxicity of GFNs is widely dependent on their physico-chemical characteristics, suggesting that from all the GFNs studied, P4 and P5 (graphene nanoplatelets and single layer graphene oxide powder, respectively) were the most cytotoxic to RAW264.7 cells.

O grafeno tem a espessura de um único átomo de carbono, de duas dimensões, arranjado de forma hexagonal e desde o seu isolamento, as suas propriedades têm sido bastante estudadas, sendo o grafeno e os materiais baseados no grafeno aplicados em diversas áreas. Vários tipos de nanomateriais de grafeno têm sido sintetizados e vastamente aplicados, contudo existe ainda algum desconhecimento acerca dos seus potenciais efeitos na saúde humana, sobretudo porque estes nanomateriais podem ser facilmente inalados, especialmente no processo de manufatura, caso não existam os devidos cuidados. Neste trabalho, um conjunto de compostos de grafeno foram selecionados para avaliação do seu efeito citotóxico em macrófagos RAW264.7. Como referência foi usado o bem caracterizado negro de carvão. As células foram expostas às doses BMD30 e 0.5BMD30, definidas por estudos anteriores. Para tal avaliou-se o grau de internalização das diferentes GFNs (família dos nanomateriais de grafeno) pelas células RAW264.7, assim como os potenciais efeitos oxidativos pela avaliação na produção de ROS. Os GFNs P4, P5 e P6 foram selecionados para estudos adicionais devido ao seu alto potencial tóxico. Foram estudados os mecanismos de morte induzida para os GFNs P4, P5 e P6 pela avaliação da percentagem de células em apoptose / necrose e pelo potencial de membrana mitocondrial. Os resultados mostraram que todos os GFNs testados foram internalizados pelas células RAW 264.7, mas a P3, P4 e P5 (carboxil grafeno, nanoplaquetas de grafeno e óxido de grafeno de camada única, respetivamente) foram internalizados em proporções mais altas. Para P1, P2, P3, P5 e P6, observou-se um aumento na internalização de nanomateriais dependente da duração de exposição aos mesmos. Além disso, os GFNs P2, P3, P4, P6 e P8 mostraram um aumento da produção de ROS nas concentrações de 0.5BMD30, mas não nas concentrações de BMD30. Os resultados mostraram que P4 e P5 aumentaram o número de células apoptóticas e a diminuíram o potencial da membrana mitocondrial nas células RAW 264.7. Em geral, os nossos resultados demonstraram que a toxicidade dos GFNs é amplamente dependente das suas características físico-químicas, sugerindo que de todos os GFNs estudados, os P4 e P5 (nanoplaquetas de grafeno e pó de óxido de grafeno de camada única, respetivamente) foram os mais citotóxicas para as células RAW264.7.