Estudos moleculares da sinalização por receptores de quimiocinas

Abstract

A clarificação da função de receptors de quimiocinas ainda não se encontra totalmente elucidada. Em particular, o trabalho realizado incidiu sobre a caracterização de dois receptores humanos de quimiocinas: CXCR4 e CCR2. Experiências preliminaries sobre o CXCR4 envolveram o desenvolvimento e caracterização de um novo anticorpo policlonal SZ1397. As condições de transfecção, imunoprecipitação e detecção de amostras derivadas das linhas celulares J-Jahn, 300-19 e COS-7 foram optimizadas. O anticorpo anti-CXCR4, SZ1397, permitiu a detecção do receptor humano transfectado e endógeno. Desta forma, foi possível determinar que este receptor migra em SDS-PAGE com o peso molecular aparente de 40KDa. Adicionalmente, foram parcialmente caracterizadas e definidas importantes diferenças na via de transdução de sinal iniciada por dois ligandos do CCR2: o agonista MCP-1 e o antagonista eotaxina. Estes ligandos induzem a activação da cinase regulada por sinais extracelulares (ERK). Contudo, observou-se que a fosfatidilinositol 3- cinase é essencial para a activação da ERK, após estimulação com eotaxina, contrariamente ao que ocorre após estimulação com MCP-1. A activação da ERK pelos dois ligandos implica também a activação da cinase da ERK (MEK) e da c-Raf.

The clarification of chemokine receptor function is still not fully elucidated. In particular, the work undertaken was concerned with the characterization of two known human chemokine receptors: CXCR4 and CCR2. Preliminary experiments on CXCR4 involved the development and characterization of a new polyclonal antibody, designated SZ1397. Transfection, immunoprecipitation and detection conditions of sample derived from different cell lines, J-Jahn, 300-19 and COS-7, were optimized. The anti-CXCR4 antibody, SZ1397, allowed the detection of the human transfected and endogenous receptor. Thus, it was possible to determine that the human receptor migrated in SDS-PAGE with an apparent molecular weight of 40KDa. Furthermore, we partially characterized and defined important differences in the signal transduction pathways of two CCR2 ligands: the agonist MCP-1 and the so called antagonist eotaxin. Both ligands induce the activation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK). However, it was seen that phosphatidylinositol 3-kinase is essential for eotaxin-mediated ERK activation, but not for that induced by MCP-1. ERK kinase (MEK) and c-Raf activation is also necessary for ERK activation upon stimulation with MCP-1 or eotaxin.